荧光分析技术在现代分析化学中的应用

荧光分析技术在现代分析化学中的应用

0荧光检测系统的设计思路荧光分析方法广泛应用于食品、生物、长寿等领域。通过荧光定量分析，我们可以提供重要的参数信息，如激发光谱、荧光光谱、荧光强度、荧光效率和荧光寿命。但是,由于物质存在自身所发出的或受激发所产生的荧光,一般具有荧光强度低或荧光寿命短以及荧光效率不高的缺陷,因此在荧光检测系统的开发中,为了从噪声中有效提取荧光信号,设计实用合理的低噪声、高信噪比微弱荧光检测电路对提高系统的性能具有重要作用。本文结合多组分检测光纤三维荧光计的荧光检测电路的设计,讨论微弱荧光信号检测关键电路的设计与实现。1计算机荧光信号的获取海洋有机物多组分检测光纤三维荧光计的荧光检测电路系统由光电探测器件、前置微弱信号放大电路、滤波电路、信号处理电路、精密电源电路等组成。由荧光敏感光电器件获取荧光信号,经过前置低噪声放大器放大后送入信号处理电路进行处理,并在采取相应的抗干扰滤波措施后将荧光信号转换成数字信号,送入计算机进行进一步分析与处理,实现待测量的荧光特性分析结果的输出、显示。基本结构如图1所示。2噪声抑制技术对微弱荧光信号的检测,基于系统的带宽与增益、信噪比与工作稳定性的要求,准确分析系统各环节的噪声来源和采取适当的噪声抑制技术对系统电路设计具有重要意义。根据微弱荧光信号检测系统的结构,造成该系统信噪比恶化的主要噪声来源是:光源的噪声、探测器和背景噪声、电子电路本身固有噪声与引入的外来干扰噪声等。2.1光电转换检测荧光微弱信号检测电路中可供选择的光电转换器件有:光电二极管、光电倍增管(PMT)和电荷耦合器CCD(ChargeCoupledDevice)等。根据海洋黄色物质、藻类、矿物油等组分的激发光谱与产生的荧光光谱的范围在200nm～1000nm之间,作为参考信号检测的光电转换器,选择具有动态范围大、低噪声、高灵敏度,暗电流小、高阻抗的PIN即可满足要求;基于CCD具有将空间信息变换成适合数字处理的脉冲信号的特点,系统采用线阵CCD作为荧光信号通道的光电转换检测器,以满足多波长扫描三维荧光光谱分析的需要。光电转换器的主要噪声来源是:a)热噪声:来源于热致电子从价带到导带的跃迁,随温度升高而增加;T为常数,禁带宽度越小,热噪声越高。b)散粒噪声:光注入光敏区看成随机过程,单位时间内产生的光生电荷数目在平均值上微小波动,形成散粒噪声;具有白噪声特点,与频率无关,是器件极限噪声的决定性因素,可通过降低温度控制。c)低频噪声:在低频范围小于几kHz,与器件有关,噪声功率与光辐射调制频率f成反比;实验表明,探测器表面的工艺状态(缺陷)、不均匀性对这种噪声的贡献很大,即表面噪声或过剩噪声或1/f噪声。检测系统设计的关键是在充分利用光电探测器的灵敏度的前提下,先满足系统的噪声指标,再校准系统增益与带宽的要求。2.2应用电路参数干扰消除装置的方法微弱光信号经过光电探测器转换成电信号后,还要经过相应的滤波、放大、信号处理等电路环节进行必要的处理,由于电路系统自身与外来干扰的存在,不可避免带来不利的噪声信号,这些电路环节的噪声来源主要是:a)电阻与IC器件的热噪声、散粒噪声,与系统的带宽、增益和工作温度相关。基于这些噪声现象具有随机过程的特征,根据其统计规律,可以通过器件的筛选、系统带宽和增益的合理配置等措施来控制其影响程度,但不能够完全消除。b)集成放大器偏置电流的温度漂移和电路板上的泄露电流通过公共阻抗引入的干扰噪声信号,对前者可通过低温度漂移的器件选择与工作环境的温度控制以减小,后者可以通过优化SMT工艺设计、选取绝缘性能良好的器件以减小线路泄露电流。在电路工艺方面,对系统电路板上的大电压梯度要进行有效隔离,以保证减小器件、印制线间的寄生泄露电流的影响。关键性的反馈电阻,通过选用玻璃绝缘的陶瓷电阻或薄膜电阻以及通过聚丙烯或聚苯乙烯等介质材料进行器件隔离,能够实现对泄露电流大小进行控制效果。c)来自检测电路的外部噪声信号,例如电、磁、机械作用等引起的杂波干扰,大多具有一定的规律性,采取适当的电磁屏蔽和滤波措施可以将其减小或消除。d)纹波干扰,这是由于来自系统电源的工频高次谐波进入信号处理电路而产生的,在技术上可通过应用精密稳压电源,并在电源供电环节加强滤波措施对纹波干扰进行控制与隔离。实际应用中,可以对各级单元电路的电源入口以及集成电路的电源供电端口采用高频和低频干扰滤波处理,能够得到很好的效果。3低噪声设计用于检测弱光信号系统3.1制备一定起伏波动由于系统激发光源的发光强度受系统工作环境、工作电源电压波动等因素的影响,产生一定的起伏波动,从而使激发的荧光强度跟随波动,对测量结果的准确性产生较大的影响。系统设计中采用双光路结构,参考信号与荧光信号经过自己的信号处理电路处理,进入计算机完成归一化处理,从而达到消除激发光源光强波动因素和背景杂散光的影响。3.2性能指标的确定前置级放大器是测量系统的关键环节,其精度、稳定度、灵敏度直接决定了系统的性能指标。系统采用高性能场效应管作为输入级的低偏置、低漂移、高增益的精密运放,作为前置放大器使用,如图2所示。3.2.1反馈电阻rf的计算根据系统的最高灵敏度、检测的动态范围和前置级增益要求,由u0=IfRf确定反馈电阻Rf的大小。由于集成电路(IC)放大器偏流和反馈电阻热噪声的影响,一般反馈电阻不应大于1000MΩ,否则在IC器件的选择和电路工作的稳定性方面将产生困难。3.2.2电池输出失调电压波动的影响由于光电转换器等效内阻的热稳定的波动范围很大,一般温度从室温到+70℃变化,直流噪声增益将变化一个数量级,对放大器输出失调电压的波动将会带来极大的影响。同时,放大器偏流的波动将直接影响检测电路的最高灵敏度。实际应用中,通过使放大器工作在较低的电源电压和采取相应的降温措施来克服直流噪声漂移,并在图2中设置外部失调调零电路(R1、R2、R3、C1),进一步减小初始失调电压的影响。3.2.3电容cf的选择放大器交流设计分析的关键是电路系统的噪声增益与频率的变换关系。利用波特(Bode)图可以较为方便地进行噪声增益频率特性分析,反馈电容Cf的选择决定了实际信号的带宽和相位容限,其影响关系是:减小的电容能够获取信号带宽的增加,使相位容限相应减小。根据光电转换器模型、反馈电阻大小、IC放大器输入端等效电容、信号带宽与闭环带宽的参数要求,以实现对反馈电容的选择。3.3微控制器结构微弱信号检测的一般方法包括同步积分法、锁定接收法、相关分析法、小波变换分析法以及取样积分法等。Boxcar取样积分法兼顾了同步积累法与频率锁定法的特点,具有很强的噪声抑制能力;小波分析与相关分析法由于具有较复杂的计算过程,因此采用Boxcar取样积分法作为微弱信号处理电路。图3为Boxcar取样积分器结构。Boxcar取样积分器是利用周期性信号的重复性,通过在每个周期内对信号的一部分取样,依靠积分器的平均作用实现从噪声湮没的信号中提取有用的荧光信息。根据取样积分器的理论,取样积分器输出端的信噪比改善RSNR为:RSNR=4RCTSTΔfni(1)RSΝR=4RCΤSΤΔfni(1)式中:T为输入信号的周期;TS为扫描周期;Δfni为输入白噪声的带宽。由式(1)不难看出,增加积分器的时间常数RC,将使信噪比得到改善,但是会带来测量时间的延长和信号高频端的失真,设计时应从仪器的响应速度、带宽、系统的信噪比综合考虑RC的大小。4噪比荧光信号检测电路的设计思考基于现有的光电敏感