黄连素抗糖尿病大鼠肾损伤的作用机制研究

黄连素抗糖尿病大鼠肾损伤的作用机制研究

黄连素（c20h18no4）+，又名小碱性）是从毛科植物（cr）和黄柏（copdicformulation）的根中提取的异羟色胺碱。既往研究证实:黄连素具有降低血糖、抑制醛糖还原酶(aldosereductase,AR)、调节脂质代谢、改善胰岛素抵抗等药理作用。但有关黄连素对糖尿病微血管并发症如糖尿病肾病的药理作用及其机制的研究报道较少,为此,本研究应用腹腔注射链脲佐菌素的方法复制大鼠糖尿病肾损伤模型,观察黄连素对糖尿病肾损伤大鼠肾功能的保护作用,并从抗氧化应激、调节肾脏醛糖还原酶活性及其基因表达方面探讨黄连素抗糖尿病大鼠肾损伤、保护肾功能的作用机制,为黄连素防治糖尿病肾损伤的临床应用提供深入的实验依据。1材料和方法1.1实验动物中心健康♂Wistar大鼠,SPF级,35只,体重(250±20)g,购自南方医科大学实验动物中心,实验动物质量合格证明号:0005201。1.2国内外生产设备链脲佐菌素(streptozotocin,STZ):美国Sigma公司生产,进口分装,广州博理生物公司供应。黄连素由陕西赛得高科生物科技有限公司提供,批号:20050220,中山大学测试中心鉴定纯度为95.13%。1.3动物室内温度、湿度、通气次数及通气次数实验在中山大学实验动物中心动物实验部SPF实验室进行,动物室内温度20℃～25℃、相对湿度40%～70%、换气次数10～15次/h。实验环境合格证号:粤监证字2004B029,动物实验设施使用证明号:0001066。1.4糖尿病大鼠模型用注射链脲佐菌素方法复制糖尿病大鼠肾损伤模型。大鼠禁食6h,以50mg·kg-1的剂量一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ,以枸橼酸钠溶液稀释,pH4.0,冰盒中新鲜配制),72h后用OoneTouch血糖仪(美国强生公司)测定血糖,以禁食6h血糖≥16.7mmol·L-1者,为糖尿病大鼠模型,共喂养12wk。1.5黄连素的体外药动学选糖尿病模型大鼠20只,随机分为模型对照组、黄连素组,每组10只,设正常对照大鼠10只。模型成功后次日,黄连素用0.5%羧甲基纤维素钠溶液制成混悬液,给药剂量为200mg·kg-1,给药容量为每100g体重1ml,模型对照组和正常对照组均给予等体积溶媒。每天8～9am灌胃,每周给药6d,共12wk。1.6血糖、血脂和丙二醛含量实验结束前1d,各组大鼠用代谢笼收集24h尿液,测24h尿蛋白(UP24h);大鼠空腹6h后称重,乙醚麻醉,腹主动脉取血,分离血清测空腹血糖(FBG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。用预冷生理盐水灌洗肾脏,去除被膜,用滤纸吸干血迹后称重,切取1cm3大小肾皮质放入液氮中速冻后转移到-80℃保存,待测肾组织醛糖还原酶(AR)活性及其基因表达。1.7血糖、bun、scr检测称量肾重和体重,计算肾脏肥大指数(肾重/体重,KW/BW);用葡萄糖氧化酶法检测血糖;BUN、Scr分别用酶法、速率法由BeckmanCX-5全自动生化分析仪进行检测;UP24h测定用磺基水杨酸—硫酸钠比浊法。1.8mda含量测定用黄嘌呤氧化酶法检测血清中SOD活性;用硫代巴比妥酸法(TBA)检测血清中MDA含量。该检测使用的试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。1.9肝肾醇糖还原酶的活性与基因发现的检测1.9.1ar活性测定roth-pcr反应体系及检测方法取80～100mg肾皮质,按1∶4(W/V)加入Tri-HCl制成组织匀浆液,超声破碎处理,低温离心12000r·min-1,离心30min,上清即为酶粗提取液,整个样本处理过程均在4℃下进行。AR活性测定以DL-甘油醛为底物,反应体系为134mmol·L-1钠-钾磷酸缓冲液(pH6.2),2mol·L-1硫酸铵,1mmol·L-1NADPH(分析纯,Roth),100mmol·L-1DL-甘油醛(分析纯,Sigma),50μl酶粗提取液,总反应体积1ml。反应自加入底物开始,37℃反应3min。空白对照不加底物。用紫外分光光度计测定NADPH在340nm吸光值(OD值)的下降表示AR活性。AR活性单位定义为每克蛋白质每分钟消耗1μmolNADPH(μmol·g-1Pro·min-1)。1.9.2mrna表达量用TRIzol试剂(Invitrogen公司)按说明书提取肾皮质样本的总RNA,RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)进行逆转录和PCR扩增反应,42℃逆转录60min,94℃灭活逆转录酶3min,94℃变性1min,60℃复性1min,72℃延伸2min,共33个循环,扩增产物长度670bp。LABWORK图像分析系统(genecompanylimited)进行灰度扫描分析,AR与β-actin(内参照)灰度比值代表mRNA表达的半定量值。AR引物序列分别为:正义5′-ACTGCCATTGCAAAGGCATCGTGGT-3′;反义5′-CCCCCATAGGACTGGAGTTCTAAGC-3′。1.10方差分析实验数据用SPSS11.5统计软件分析比较,多组比较用方差分析(单因素方差分析、LSD法),组间比较、组内比较用t检验。结果用x¯±sx¯±s表示。2结果2.1基肥指数、血糖、bun、cr、up对从Tab1看出,糖尿病模型组与正常对照组相比,体重明显下降,肾脏肥大指数、血糖、BUN、Cr、UP24h均明显升高(P<0.05)。与模型组相比,黄连素能有效控制体重下降,明显改善肾脏肥大指数,明显降低血糖、BUN、Cr、UP24h等指标(P<0.05)。2.2脂质过氧化物代谢产物的活性、丙二醛mda的变化,其丙二醛mda的代谢产物的代谢产物的含量,其从Fig1、2看出,与正常组相比,模型组血清中超氧化物歧化酶(SOD)的活性明显下降(P<0.05),而脂质过氧化物代谢产物丙二醛(MDA)的含量明显增加(P<0.05)。黄连素组与模型组相比较,血清SOD活性明显增加(P<0.05),MDA含量明显下降(P<0.05)。2.3各组肾组织ar活性及mrna的表达比较从Fig3、Fig4A、4B看出,糖尿病模型组与正常对照组相比,肾组织AR活性及其mRNA的表达明显增强(P<0.05),黄连素组与模型组相比能够明显降低肾组织AR活性,下调ARmRNA的表达(P<0.05)。3黄连素治疗糖尿病肾损伤的机制糖尿病肾病的病理改变包括肾脏肥大、肾小球毛细胞血管基膜增厚,肾小管肥大,间质性纤维化和肾血管硬化,尤其以肾小球系膜外基质(ECM)进行性积聚、肾功能恶化和蛋白尿为特征。STZ诱导的大鼠糖尿病肾病的病理改变和肾功能损害与人类非常相似。因此,本研究应用链脲佐菌素注射Wistar大鼠,实验结束时(12wk),糖尿病模型组大鼠血糖维持在较高水平、肾脏肥大指数(肾重/体重)、尿素氮、血肌酐、24h尿蛋白等较正常组明显升高,提示肾脏肥大、肾小球受损和肾功能障碍的形成。黄连素组的肾脏肥大指数、血糖、血肌酐、尿素氮、24h尿蛋白等与模型组相比明显降低,提示黄连素除了有效降低糖尿病肾损伤大鼠空腹血糖,还可以明显改善其肾功能。研究认为:糖尿病状态下多元醇代谢通路激活,抗氧化能力下降,机体氧化应激增加。醛糖还原酶(AR)是多元醇通路中重要的限速酶,持续高血糖刺激下,细胞内多元醇代谢通路被激活,葡萄糖在AR的催化下还原为渗透性强的山梨醇,后者在山梨醇脱氢酶(SDH)作用下转化成果糖,细胞内山梨醇的积聚使肌醇等其他渗透质发生代偿性向下调节,Na+,K+-ATP酶活性下降,造成细胞渗透性水肿和肾小管重吸收功能障碍;同时NADPH的消耗增加使还原型谷胱甘肽生成减少,自由基清除减少,机体抗氧化能力下降,从而引起了细胞氧化应激损伤。另外醛糖还原酶活性增强直接或间接地激活PKC或MAPK通路,磷酸化核转录因子AP-1或CREB等,引起TGF-β、FN等活性产物的增加,导致肾小球毛细血管细胞基膜的增厚及肾小球系膜细胞、细胞外基质的积聚,从而使肾脏结构和功能的改变,促进了DN的形成。因此肾组织AR活性的增强,机体抗氧化能力低下与糖尿病肾损伤的发生、发展关系密切。本研究结果显示:糖尿病模型组大鼠12wk后肾功能明显受损,同时血清抗氧化酶SOD活性低下,脂质过氧化代谢产物MDA含量增加、AR活性与基因表达明显升高,佐证糖尿病早期肾功能受损与机体氧化应激增强、肾组织AR活性增高以致多元醇通