链霉菌阿维菌素的分离、纯化及生物活性

链霉菌阿维菌素的分离、纯化及生物活性

1975年，日本北理研究所从静冈区义东市河奈区的土壤样本中分离出一条链霉菌（strepticma-4700）。发现该菌株的发芽液具有很高的抗肠道寄生虫活性，对哺乳动物的毒性非常低。即使浓度增加了八倍，也不会发现毒性。随后,美国Merk公司从该菌发酵菌丝中提取出一族结构相似的十六元大环内酯类化合物,并命名为阿维菌素(avermectins,简称AVM)。AVM包含有8个结构相似的天然组分,分别编号为A1a、A2a、A1b、A2b、B1a、B2a、B1b和B2b,其中A1a、A2a、B1a、B2a是大量组分,占总含量的80%以上;A1b、A2b、B1b、B2b是少量组分,占总含量的20%以下。B1组分的杀虫活性最高,商品化的AVM即为B1a(≥80%)与B1b(≤20%)的混合物。1981年,阿维菌素作为兽药投入市场,1985年作为农药投入市场。中国从20世纪80年代末开始对阿维菌素的研究,1994年临时登记了第1个1.8%阿维菌素乳油,1996年登记了第1个阿维菌素原药,到目前为止,约有30多家企业登记了阿维菌素原药。阿维菌素是迄今发现的最有效的杀昆虫剂、杀螨虫剂和杀寄生虫剂之一。1阿维菌素的调节作用与其他杀虫剂不同,阿维菌素既不抑制胆碱酯酶,也不抑制虫体内蛋白质、核酸等有机物的合成。AVM作用机制最初的解释为:γ–氨基丁酸(GABA)是线虫传出神经系统中的一种神经递质,当神经冲动到达神经末梢时,神经末梢的细胞膜释放出GABA,作用于次级神经元细胞膜或效应器细胞膜,产生抑制效应,完成神经冲动的传递过程。当AVM进入靶标生物体后,表现为对GABA的激动作用,使神经末梢细胞膜大量释放GABA,并能促进GABA与次级神经元细胞膜或效应器细胞膜的结合,产生长时间的高强度抑制效应,使线虫麻痹死亡。但是后来研究发现,当AVM浓度较低时,可引起与GABA系统无关的Cl–通道的开放。大量研究表明,AVM可引起谷氨酸控制的Cl–通道的开放,从而导致膜对Cl–通透性增加,带负电荷的Cl–会引起神经元休止电位的超极化,使正常的电动电位不能释放,神经传导受阻,最终导致虫体麻痹死亡。阿维菌素对哺乳动物有很强的选择性。哺乳动物外周神经传导介质为乙酰胆碱(Ach),以GABA作传导介质的神经仅存在于中枢神经系统,由于哺乳动物具有血脑屏障,因而药物进入中枢神经系统的数量很少。此外,至今尚未发现在哺乳动物体内存在受谷氨酸控制的Cl–通道。因此,AVM对哺乳动物具有很高的安全性。2急性毒性药大鼠毒理学研究表明,阿维菌素无三致作用(致畸、致癌、致突变)。急性毒性试验结果表明,阿维菌素原药(阿维菌素B1含量>95%)对大鼠急性经口LD50为10~27mg/kg,按照中国农药毒性分级标准,属高毒杀虫剂,原药对小鼠急性经口LD50为13mg/kg;兔急性经皮LD50>2000mg/kg,大鼠急性经皮LD50>380mg/kg;大鼠急性吸入雄性LD50为209.12mg/m3,中等毒性,雌性LD50为156.89mg/m3,高毒。对水生生物高毒,鳟鱼96hLC50为3.6μg/L,蓝鳃翻车鱼96hLC50为9.6μg/L。对蜜蜂高毒,经口LD50为0.009g/头,接触LD50为0.002g/头,但残留在叶面的LT50为4h,4h以后残留在叶面的药剂对蜜蜂低毒。对鸟类低毒,鹌鹑急性经口LD50为86.4mg/kg,鸽子为537mg/kg。3关于疗效的研究3.1阿维菌素对2龄幼虫的渗透能力阿维菌素对多种植物线虫均有较好的控制作用。1.8%阿维菌素乳油对南方根结线虫具有很强的杀线活性。1.8%阿维菌素乳油质量浓度为10、5、2.5、1.25、0.625mg/L时,对南方根结线虫的校正死亡率分别为80.47%、69.51%、58.87%、47.80%和35.13%。药剂处理24h,阿维菌素对南方根结线虫的LC50值为1.48mg/L。阿维菌素对南方根结线虫的毒杀作用随处理时间延长而增大。阿维菌素处理2龄幼虫2、24、48h后,LD50分别为63.6051、8.5111和7.3461μg/mL。阿维菌素抑制2龄幼虫的侵入能力,线虫侵染率随药剂浓度增大而降低。阿维菌素0.5、2μg/mL处理根结线虫,48h后2龄幼虫对番茄根部的侵入率分别为8.32%、0.12%,而对照处理线虫的侵入率为21.85%。阿维菌素(24h)对南方根结线虫、肾形线虫的致死中浓度分别为1.56μg/mL和32.9μg/mL,阿维菌素还可降低南方根结线虫、肾形线虫对番茄的侵染力。阿维菌素对松材线虫具较强的杀灭作用,且对松材线虫的繁殖也有较强的抑制作用。阿维菌素50、500μg/mL处理24h后,线虫校正死亡率分别为83.05%、95.96%。500μg/mL阿维菌素处理5d后,线虫繁殖抑制率为100%。阿维菌素与硫酸铜联合使用对松材线虫毒性增强。阿维菌素和吡虫啉联合染毒,也对松材线虫表现出增效作用。阿维菌素对甘薯茎线虫和穿刺短体线虫均有较好的杀灭效果。阿维菌素400mg/L以下时,河北省昌黎、涿州、卢龙和抚宁4地甘薯茎线虫的死亡率均在45%以下,但当用量增大到600mg/L时,其死亡率陡增,达到90%以上。阿维菌素不同浓度处理穿刺短体线虫0.5h后,线虫校正死亡率随处理浓度升高而增加,当阿维菌素浓度为200mg/mL时,供试线虫校正死亡率达到100%。处理浓度不变,延长处理时间可提高穿刺短体线虫的校正死亡率。3.2阿维菌素防治新疆杨线虫的效果阿维菌素有种子处理、播前或定植前穴施、生长期灌根、叶面喷施、植株根部注射等多种田间施药方式。1.8%阿维菌素乳油600mL/hm2播前毒土处理,对黄瓜根结线虫病的防效为59.38%。阿维菌素播前1mL/m2表面喷施(土壤混合施药),西瓜根结线虫病的病情指数、根结数量、根结重/根重分别比对照降低47.04%、48.32%、23.47%。0.5%阿维菌素颗粒剂播前施药2000、3000、3500g/667m2,对黄瓜根结线虫病的防效为66.61%~74.63%;定植前穴施3000、3250、3500g/667m2,防效分别为67.1%、72.1%、78.6%。1.8%阿维菌素乳油3000mL/hm2灌根,对不同作物上南方根结线虫的平均防效为76%~82%。番茄定植30d后,2%阿维菌素1000倍液50mL灌根处理,40d后对根结线虫的防治效果为66.3%。香蕉茎基部注射阿维菌素,可以有效控制爪哇根结线虫和香蕉相似穿孔线虫的侵染。线虫接种28d或56d后注射施药,阿维菌素(250、500μg/株)对爪哇根结线虫和香蕉相似穿孔线虫均表现出显著防效。1.2%阿维菌素微胶囊悬浮剂按病树胸径每厘米用药0.08、1.0、1.2mL,60d后对松材线虫的防治效果分别为73.33%、86.66%、93.33%。阿维菌素不同用药方式对线虫防治效果有差异。25%阿维菌素乳油1000倍液灌根,施药7、15、25d后新疆杨线虫平均减退率分别为64.5%、60.8%、53.7%;而阿维菌素1500g/hm2土壤处理,防治7、15、25d后,线虫平均减退率分别为39.6%、22.4%、8.8%。防治新疆杨线虫,根灌效果好于土壤处理。阿维菌素处理种子,可以减少线虫对植物的侵染,同时促进植株生长。阿维菌素100g/100kg处理棉花种子,定植35d后,棉花根部根结线虫卵数为8472,比对照降低73.82%;株高23.1cm,比对照增加22.87%。阿维菌素0.1mg处理种子,玉米短体线虫和棉花上南方根结线虫的减退率均达80%以上,0.3mg处理,甜菜异皮线虫的减退率为60%。1.8%阿维菌素可湿性粉剂5g/100kg拌种大豆种子,大豆苗期根数、株高和单株鲜重分别较对照增加16.25%、18.60%和4.94%;大豆产量增加5.56%。目前,市售阿维菌素有乳油、颗粒剂、可湿性粉剂、粉剂等不同剂型,同一剂型的有效成分含量又有不同。不同含量、不同剂型的阿维菌素处理均可以很好地控制植物线虫。1.8%阿维菌素乳油15L/m2处理温室土壤,药后90d土壤中黄瓜根结线虫、番茄根结线虫2龄幼虫数量减退率分别为10.04%、75.68%,防效分别为46.5%、62.87%;用量20kg/hm2,药后60、90d对苦瓜根结线虫的防治效果分别为62.7%、50.5%。2%阿维菌素乳油1000倍液处理播前土壤,药后45d牛蒡根结线虫虫口减退率为68.5%,病情指数下降52.34%。10%阿维菌素颗粒剂3kg/667m2拌土沟施,对黄瓜根结线虫的防治效果为71.17%。0.26%阿维菌素粉剂2.25、3.0、4.0kg/667m2,药后20d对花生根结线虫病的防效分别为54.1%、74.1%、68.2%;药后45d的防效分别为66.7%、85.2%、81.5%。1.8%阿维菌素乳油用量0.1、0.15、0.2mL,对香蕉穿孔线虫的防效分别为92.78%、94.35%、96.09%;0.5%阿维菌素颗粒剂用量3、3.5、4g,对香蕉穿孔线虫的防效分别为98.26%、99.39%、100%。1.8%阿维菌素乳油、0.5%阿维菌素颗粒剂对香蕉穿孔线虫均表现良好的防治效果,两者差异不显著。0.5%阿维菌素颗粒剂45kg/hm2拌沙沟施,能抑制半穿刺线虫在土壤中和根上的虫口密度,对土壤中和根上虫口的平均防效分别为68.65%和65.89%。24.5%阿维菌素乳油2000倍液1800L/hm2淋根,可显著抑制半穿刺线虫在土壤中和根上的虫口密度,对土壤中和根上虫口的平均防效分别为75.90%和74.39%。阿维菌素对草莓滑刃线虫的控制效果因寄主植物而异。阿维菌素0.005g/L处理,对侵染紫花野芝麻的草莓滑刃线虫防效达81.23%以上;用量增大到0.011g/L,仍不能控制侵染比利时杜鹃和秋海棠的草莓滑刃线虫。阿维菌素对线虫的防效随用药次数增加而增大。阿维菌素不仅能够很好地控制植物寄生线虫,并且能够促进植株生长。阿维菌素对胡椒根结线虫、榕树根结线虫均有较好的防治效果。阿维菌素不同剂量处理均能减少植株根部卵囊、雌虫数量、根结数及土壤中2龄幼虫数量。高浓度1.5×10–3处理,油菜株高增长率最高19.1%,茎鲜重增长率中等,为42.6%;中浓度1.0×10–3处理,油菜株高增长率中等,为15.7%,茎鲜重增长率最高,为52.8%。将鳞球茎茎线虫置于阿维菌素稀释液中(0.018、0.036、0.072g/L)浸泡4h,50%线虫失去活动力。将浸泡后线虫接种大蒜,与对照相比,阿维菌素0.072g/L处理,每平米蒜株数增加3.20%,大蒜横径增大,大蒜产量增加12.87%,且线虫侵染率仅为7%。小麦返青期沟施0.5%阿维菌素颗粒剂30kg/hm2,小麦校正胞囊减退率最大(55.13%),且增产效果好,增产率为18.54%;60kg/hm2处理后小麦株高平均值最大(59.32cm),植株增高明显。1.8%阿维菌素乳油3000倍液浇窝,对甘薯茎线虫的防治效果为77.3%,薯块增产12.9%。1.8%阿维菌素乳油0.99mL/m2,药后49d栝楼根结线虫2龄幼虫虫口减退率为89.6%;药后124d,栝楼增果率为250%。阿维菌素作用机制独特,且具有较长的持效期。香蕉茎基部注射阿维菌素,药剂在香蕉树中持效期至少可达56d。香蕉施药(100μg/株)28d后分别接种爪哇根结线虫和香蕉相似穿孔线虫,28d后,阿维菌素对2种线虫的控制效果仍分别高达100%和84.46%。2%阿维菌素乳油稀释500倍液灌根,12周后对盆景根围的植物病原线虫减退率高达95.2%。2%阿维菌素乳油连续2年在16棵黑松上注干防治松材线虫,注药量400mL/m3(60mL/株),第1年对松材线虫的防效达到100%,第2年为88%,持效期2年。取样检查树体内线虫,距地面4m处的树干内没有发现任何线虫,说明药剂被注入树干的芯材部位后,可扩散到树体的上部。1.8%阿维菌素乳油40mL/m2拌毒土,药后45、70d对黄瓜根结线虫的防效分别为62.9%、13.2%;天线一号(0.5%阿维菌素可湿性粉剂)2.5kg/667m2拌土,药后45、70d对黄瓜根结线虫的防效分别为69.6%、77.1%,阿维菌素可湿性粉剂持效期较乳油好。阿维菌素对根结线虫的防效优于常规杀虫剂。阿维菌素、噻唑磷、灭线磷、敌敌畏、吡虫啉、毒死蜱、敌百虫对根结线虫的防效分别为35%、27%、20%、20%、20%、20%、13%,1.8%,阿维菌素防治效果最好。将阿维菌素与其他化学药剂联合使用可以提高单剂的防治效果。0.2%阿维菌素和3%吡虫啉、1%阿维菌素和1%苦参碱2个药剂组合林间注干施药(施药剂量2mL/cm胸径)防治松材线虫,第1年防治效果均为100%,第2年防效分别为