国欣棉3号幼苗根系活性氧代谢与dpc浸种的互作

国欣棉3号幼苗根系活性氧代谢与dpc浸种的互作

氨基乙酰胺（dpc）是一种植物生长缓冲剂，其名称为1.1-甲基二羟氯仿胺（1,1-）。赤霉素的生物合成可以从80年代开始。20世纪80年代以来，中国和美国等主要的棉花国家广泛用于控制棉花产量。除了控制徒长,DPC还可促进棉花根系和产量器官的发育,并能增强根系活力、提高根系功能。根系活力主要反映根系生命活动的旺盛程度和吸收、合成等功能的强弱程度。已有报道指出,DPC处理可以提高棉株根系合成氨基酸的能力,增加伤流液的溢泌量,增强对氮、磷、钾等矿质养分的吸收。但迄今为止,尚不清楚DPC提高棉花根系活力的生理机制。活性氧(ROS)是一类具有氧化能力的分子、离子和自由基,在植物细胞正常代谢过程中可通过多条途径产生。ROS一方面可作为信号分子参与植物生长发育、细胞程序化死亡(PCD)和生物及非生物胁迫应答等生理过程,另一方面作为强氧化剂具有极高的活性和毒性,会引起一些大分子物质(如脂质、蛋白质和DNA等)的氧化破坏,甚至引起细胞的死亡。有研究发现,DPC处理可以有效改善植株体内的ROS代谢、降低膜脂过氧化作用,从而提高植株的抗旱和耐盐能力、延缓叶片的衰老。为此我们推测,DPC处理提高棉花根系活力可能与改善根系的ROS代谢有关。本文的研究目的,一是采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色、吖啶橙染色和非损伤微测(NMT)等方法进一步验证DPC浸种提高棉花根系活力的作用,二是探究根系组织中ROS及活性氧清除酶的变化,试图从ROS代谢的角度揭示DPC浸种提高棉花根系活力的作用机制。1材料和方法1.1种子萌发dpc国欣棉3号由河北国欣种业有限公司培育并提供;DPC有效成分含量为97.5%,由河北国欣诺农生物技术有限公司生产并提供。选取均匀饱满的种子分别置于清水(对照)和200mgL–1的DPC溶液中,于28℃下浸泡12h,然后用清水将种子冲洗干净,于去离子水冲洗过的细河沙中萌发。培养室光照/黑暗时长为12h/12h,温度为(30±2)℃/(20±2)℃。萌发5d后子叶展开,小心取出均匀一致的幼苗进行测定。1.2生理指标及分析方法根系活力用氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法测定根系的还原能力。根尖TTC染色及观察,用双面刀片切下2~3cm长的根尖,迅速浸入含0.6%TTC的磷酸缓冲液(50mmolL–1,pH7.4),在30℃下避光染色24h,然后将样品转入55℃的95%酒精温育2h,取出吸干水分后在显微镜(BH-2,Olympus,Tokyo)下观察并照相。K+的净流速测定,在旭月(北京)科技有限公司采用非损伤微测技术(NMT,BIO-001B,YoungerUSASci.&Tech.Corp.,Amherst,MA,USA)测定整株幼苗根尖部位的K+流速。用蒸馏水冲洗干净幼苗根系并在其中浸泡15min,转入20mL测试液中平衡10min,再转入新的20mL测试液中开始测试。测试液配方为0.1mmolL–1KCl、0.1mmolL–1CaCl2、0.3mmolL–1MES,pH6.0;为避免引入Na+和K+,用低浓度Tris和HCl调节测试液pH值。每处理测定4株幼苗,测试部位距根尖300μm,即根系分生区;测试持续7~10min,计算时舍弃前2~3min的数据。吖啶橙染色参考Ünal和Uyanikgil的方法,将离体幼苗根系插入含有0.05mgmL–1吖啶橙的磷酸缓冲液(10mmolL–1,pH7.0),在室温下避光染色30min,然后取出用10mmolL–1磷酸缓冲液冲洗3次,吸干水分后在激光共聚焦显微镜(SP5,Leica,Germany)下观察并照相。呼吸速率应用红外线CO2分析仪(CIRAS-2portableIRGAsystem,PP-systems,Amesbury,MA,USA)测定。相对电导率参考Nayyar等的方法,应用电导仪(EC215,HannaInstruments,USA)测定。抗氧化酶活性及其同工酶染色参照Gossett等的方法,酶提取液为50mmolL–1磷酸缓冲液[pH7.0,含1%(w/v)PVP、0.1mmolL–1EDTA-Na2和0.05%(w/v)TritonX-100]。取0.5g新鲜的幼苗根尖(2~3cm长),冰浴条件下研磨成匀浆,然后在4℃下12000uf0b4g离心15min,取上清液待测。超氧化物歧化酶(SOD,EC1.15.1.1)、过氧化物酶(POD,EC1.11.1.7)、过氧化氢酶(CAT,EC1.11.1.6)、抗坏血酸氧化酶(APX,EC1.11.1.11)和谷胱甘肽还原酶(GR,EC1.6.4.2)等抗氧化酶活性的测定、同工酶分离和染色均采用Parida等的方法。H2O2活体组织原位检测参照Romreo-Puertas等的方法,将离体幼苗根系插入含1%3,3-二氨基联苯胺(DAB)的磷酸缓冲液(10mmolL–1,pH6.5),室温下避光吸收8h,取出吸干水分后在显微镜(BH-2,Olympus,Tokyo)下观察并照相。H2O2含量和超氧阴离子(O2–)生成速率,取0.5g新鲜幼苗根尖(2~3cm长),在冰浴中用100mmolL–1磷酸缓冲液(pH7.8,含1%PVP)研磨成匀浆,于4℃下12000uf0b4g离心20min,取上清液测定H2O2含量和O2–生成速率。1.3统计量的分析所有试验至少独立重复3次,各次结果趋势一致,取其中具有代表性的数值进行统计分析。用SPASS16.0(SPSSInc.Chicago,USA)的t检验对平均值进行比较(P<0.05)。2结果与分析2.1根充质原料的生理特征TTC是一种水溶性物质,通过细胞膜进入细胞内被脱氢辅酶(NADH或NADPH)还原变成红色,常用来表征根系活力。从图1可知,DPC浸种根系的TTC染色较对照深,单位面积光密度为对照的1.3倍(P<0.05)。此外,以TTC法测定的根系活力为108.4µgg–1h–1,较对照的40.6µgg–1h–1提高了167%(P<0.05)。DPC浸种处理使棉花幼苗根尖部位(2~3cm)的呼吸速率显著提高90%(图2-A),表明根系生命活动比较旺盛。根系分生区的吸收能力也得以增强,K+净内流速率由对照的–292.85pmolcm–2s–1显著增加到–399.30pmolcm–2s–1(负值表示内流,即吸收;图2-B),提高幅度为36%(P<0.05)。此外,DPC浸种处理根尖部位(2~3cm)的相对电导率由对照的64%降低到56%,提示其根系细胞膜完整性好、透性低。吖啶橙具有膜通透性,可使细胞中的DNA和RNA染色,与DNA结合时细胞核发出均匀的绿色或黄绿色荧光,与RNA结合时细胞质发出均匀的桔黄色或桔红色荧光。在凋亡的细胞中,染色质固缩或断裂为大小不等的片段,吖啶橙会使其染上致密浓染的绿色荧光。比较图3可知,DPC处理根系细胞的桔红色着色较对照均匀,荧光亮度也比较高(光密度为对照的2.3倍),表明其细胞状态正常、细胞活力较高。从图3中可见,对照根系伸长区的部分细胞中出现致密浓染的绿色荧光斑点(a区),提示该区发生了细胞凋亡,而DPC浸种根系的相应区域未发现类似现象。本试验中根系细胞胞壁的绿色荧光比较强,是因为其中的木质素也可被吖啶橙染成绿色。2.2dpc播种对pod活性和同工酶表达的影响DPC浸种处理的根系SOD活力较对照显著降低22%(表1),7条同工酶带的表达量也降低(图4),其中自上而下第2、第6、第7条酶带的光密度分别为对照的71%、53%和70%。与之相反,浸种处理的CAT、APX和GR活力分别较对照显著增加32%、67%和51%,CAT和APX同工酶带的光密度也分别较对照提高90%和70%(图4),GR自上而下第1、第4、第5条同工酶带的光密度则分别较对照提高40%、80%和50%(图4)。DPC浸种处理对POD活力和同工酶表达量均无显著影响(表1和图4)。DAB是过氧化物酶的生色底物,在H2O2存在下失去电子而形成褐色沉淀。由图5可见,DPC浸种处理根系染色较浅且染色面积较小,染色光密度仅为对照的23%。化学测定结果也显示DPC浸种处理使根系中的H2O2含量较对照降低了56%(图6)。此外,处理根系的O2–产生速率也较对照降低65%(图6)。3dpc与其他保鲜措施的相互作用根系活力泛指根系的吸收、合成及氧化和还原能力。本文结果表明,DPC浸种处理根系的还原能力(TTC法)增强(图1),呼吸速率提高(图2-A),凋亡细胞减少(图3),K+净内流速率提高(图2-B),这为DPC处理增强棉花根系活力提供了更多的证据。本文还发现,DPC浸种处理显著提高了CAT、APX和GR的活力及同工酶表达量,但降低了SOD的活力及其同工酶表达量。已有研究表明,SOD催化植物组织中的O2–生成H2O2,而CAT、APX和GR可将H2O2进一步分解为无毒害作用的H2O和O2。作者推测,DPC浸种处理既可减少幼苗根系H2O2的生成,又可加速H2O2的降解,因此显著降低了根系中H2O2的含量(图6)及其DAB染色强度(图5)。也有报道指出,DPC影响植株体内活性氧清除酶的活性,可以促进ROS的清除、维护细胞膜的稳定、延缓叶片的衰老、提高植株的耐盐能力等。O2–的产生源于电子传递链运行时电子的漏出,漏出的电子直接与O2进行单电子还原形成O2–,对细胞具有高毒性。本研究中,DPC浸种处理根系的O2–产生速率显著低于对照(图6),可能是因为处理根系较高的呼吸速率(图2-A)和/或较强的还原能力(图1)减少了电子传递链的电子漏出。以往研究证明,ROS能改变细胞内相对稳定的氧化还原状态,UV-B辐射诱导的ROS积累可以抑制NADPH硝酸还原酶的活性。Desikan等报道,外源H2O2可以激发拟南芥悬浮细胞中与细胞程序化死亡(PCD)有关的mRNA和蛋白质合成,H2O2浓度越高,细胞死亡的速度越快。Storey和Walker和马怀宇等的研究也表明,胁迫条件下果树产生大量ROS,从而诱导根系细胞死亡,加速根尖木栓化。此外,ROS能激活膜上的非选择性阳离子通道和部分外排的离子通道,促进K+的外排、降低根系细胞的净吸收能力。因此作者推测,本试验中D