葛仙米多糖的提取分离研究

葛仙米多糖的提取分离研究

葛仙米是科可见的一种低水平的单调藻类。原名为不朽之海，俗称为水上木兰。它与地木耳(Nostoccommunevanch.),发菜(N.flagelliforme)为同属植物,其出现早于螺旋藻(Spinclina)。据《本草纲目》等记载,葛仙米有治疗夜盲症,脱肛,烫伤和兼具美容之功效。据研究,葛仙米不仅蛋白质含量高,蛋白质中的氨基酸品种齐全,结构合理,基本符合FAO/WHO专家委员会于1973年推普的模式,而且,富含多糖和具有特殊的保健功能的VC、B族维生素、β-胡萝卜素、微量元素含量等营养成分。多糖是构成生命的四大基本物质之一,具有许多生物活性,包括抗肿瘤,免疫,降血糖,抗病毒等。由于多糖类化合物的独特功能和较低的毒性,在抗体,肿瘤治疗,艾滋病,抗衰老,治疗糖尿病等临床应用方面具有良好的前景。近几十年来,随着世界各国科学家对植物多糖分离纯化,结构分析,免疫学及药理学等方面研究的不断深入,寻找一种资源相对丰富,成本低廉的植物多糖已成为食品界、医学界关注的热点。目前,多糖的研究集中在药用植物多糖和真菌多糖,而对葛仙米多糖的研究较少。本项研究是葛仙米深加工的基础,葛仙米中含有丰富的生理活性物质,分离并鉴别这些物质的活性,为葛仙米深加工产业提供理论指导,提取出生理活性物质可作为生产功能保健食品的主剂或辅助成分,做成胶囊、片剂等的葛仙米保健食品。1材料和设备1.1实验材料葛仙米:湖北省鹤峰县走马镇生产。1.2酮、硫脲、硫脲、果胶酶工业酒精(95%),氯仿(AR),正丁醇(AR),蒽酮(AR),硫脲(AR),纤维素酶(15U/mg),果胶酶(20000U/g)。1.3仪器、设备和冷冻干燥机电子天平(FA2104)上海天平仪器厂;分光光度计(UV·755B)上海分析仪器总厂;旋转蒸发器(R201)上海中科机械研究所;大容量离心机(800B)上海安亭科学仪器厂;真空冷冻干燥机(ZL-1);红外光谱仪(傅利叶变换红外光谱仪)。2实验方法2.1工艺2.2葛仙米多糖的提取清洗:称取一定量的葛仙米,加水洗去葛仙米内的杂质,沥水后用蒸馏水浸泡20h,每隔5h换一次蒸馏水,使葛仙米充分溶胀,并除去一部分色素。脱色:把清洗好的葛仙米沥去大部分水,加入工业酒精,溶液颜色逐渐加深,15min后倒去深褐色的酒精,重复3次,使酒精的颜色变为淡红色。粉碎:取于50℃烘箱内烘36h的葛仙米,用万能粉碎机粉碎,过80目筛,装入试剂瓶备用。脱脂:取2.5g已粉碎的葛仙米,用甲醇于78℃回流6h进行脱脂,开始时,回流滴出的甲醇为黑色,回流结束,回流出的甲醇为淡黄色,而提取烧瓶内的甲醇颜色为墨绿色。水提:取初步脱色、脱脂的葛仙米加入三角瓶中,按料水比为1:90,于90℃的水浴锅中提取6h。浓缩:水提后的葛仙米经四层纱布过滤,所得滤液置于圆底烧瓶中,用旋转蒸发器浓缩去大部分水分。脱蛋白:本实验是采用Sevage法脱蛋白,此方法是通过调节正丁醇与三氯甲烷的比例,从而达到较好的脱蛋白效果(本实验所用的正丁醇与三氯甲烷的比例为5:2)。沉淀、脱色:本实验沉淀与脱色是同时进行的。色素易溶于有机溶剂,而多糖不溶于50%~90%的酒精。脱色是本实验的难点,要多次调整工业酒精的浓度逐步脱去多糖的色素。干燥:为了保证葛仙米多糖的功能性成分,采用真空冷冻干燥,冷冻温度为:-24℃。碱提:水提后的葛仙米经四层纱布过滤后所得的滤渣按1:25加入1mol/L于室温时稀碱液浸提6h。由于浓缩时需要加热,为了不让多糖分解,需要调节溶液的酸碱度,加入较浓的盐酸,使溶液的浓度为中性。2.3初步确定实验中的因素2.3.1提升机温度的确定取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:100加水,在不同的温度下提取5h,提取次数为3次,用蒽酮比色法测其吸光度。2.3.2游泳时间的确定取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:100加水,在90℃的条件下,提取不同的时间,提取3次,用蒽酮比色法测其吸光度。2.3.3确定混合溶液的比例取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,在90℃的条件下,提取5h,按不同的料液比提取3次,用蒽酮比色法测其吸光度。2.3.4葛仙米的酮比色法由于水提温度较高,使酶失去活性,本实验只做了酶对碱溶性粗多糖提取的影响。取2.5g葛仙米按1:90加水,在90℃的条件下,提取6h,提取3次,过滤后,按1:20加入浓度为0.75mol/L的碱液,提取5h,然后分别加入一定量的纤维素酶和果胶酶,用蒽酮比色法测其吸光度。2.3.5防水时间的确定取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:100加水,在90℃的条件下,提取5h,用蒽酮比色法测其吸光度。2.3.6碱土中酮比色法测定总酮比色法取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:90加水,在90℃的条件下,提取6h,提取3次,过滤后,按1:20加入浓度不同的碱液,提取4h,提取3次,用蒽酮比色法测其吸光度。2.3.7碱土中3%3.2%取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:90加水,在90℃的条件下,提取6h,提取3次,过滤后,按1:20加入浓度为0.75mol/L的碱液,用不同的时间提取3次,用蒽酮比色法测其吸光度。2.3.8碱土中碱液的提取取已粉碎的葛仙米2.5g,索氏提取6h,按1:90加水,在90℃的条件下,提取6h,提取3次,过滤后,按不同的比例加入浓度为0.75mol/L的碱液,提取时间为5h,提取3次,用蒽酮比色法测其吸光度。2.3.9样品的提取时间取2.5g葛仙米按1:90加水,在90℃的条件下,提取6h,提取3次,过滤后,按1:20加入浓度为0.75mol/L的碱液,提取时间为5h,提取不同的时间,用蒽酮比色法测其吸光度。2.4试验因素的最终确定2.4.1各因素间的相互影响的消除通过单因素试验知道较佳的因素水平,为了消除各因素间的相互影响,根据这些确定的因素,确定正交表的因素的各个水平。根据各实验因素水平,做正交实验。2.4.2各因素间的相互影响的消除通过单因素试验知道较佳的因素水平,为了消除各因素间的相互影响,根据这些确定的因素,确定正交表的因素的各个水平。根据各实验因素水平,做正交实验。2.5减少污染效果的调整通过实验可知:影响多糖颜色的因素除去酒精脱色、索氏回流脱色,还有脱蛋白的效果、酒精沉淀多糖时的脱色。2.5.1脱蛋白质法的确定通过比较Sevag法脱蛋白与三氯乙酸脱蛋白后的效果比较,选择Sevag法脱蛋白(正丁醇和三氯甲烷二者之和的比是5:2,脱蛋白3次)。2.5.2酒精沉淀葡萄糖浓度的调整通过调整工业酒精的浓度来沉淀多糖和去除多糖内的色素。2.6直接测定还原糖和菲林试剂的方法2.6.1计算糖含量的差异2.7葛仙米的酮比色法由于水提温度较高,使酶失去活性,本实验只做了酶对碱溶性粗多糖提取的影响。取2.5g葛仙米按1:90加水,在90℃的条件下,提取6h,提取3次,过滤后,按1:20加入浓度为0.75mol/L的碱液,提取5h,然后加入一定量的纤维素酶和果胶酶,用蒽酮比色法测其吸光度。2.8多酚组的红外光谱分析多糖制品采用溴化钾(KBr)压片,用傅利叶红外光谱仪进行扫描。3结果与分析3.1水溶液多糖的提取通过单因素试验知道较佳的水提温度是90℃,料液比为1:90,水提取时间为6h,水提取数为3次,为了消除各因素间的相互影响,根据这些确定的因素,确定正交表的因素的各个水平。根据各实验因素水平,取定容至250ml的浓缩液2ml,定容至100ml,用蒽酮比色法测其吸光度。由以上正交试验及极差分析结果可以看出,水溶性多糖的最佳提取方案为90℃,6h,1:90加水,水提取4次。对多糖影响较大的因素是多糖提取的次数,而提取温度,提取时间,料液比对多糖的得率影响不大,并且后面三者对多糖的得率影响不大。3.3正交试验结果通过单因素试验知道较佳的碱液浓度为0.75mol/L,加碱液的比例为1:25,碱提取时间为5h,碱提取数为3次,(酶的加入对碱溶性多糖的提取率影响不大)为了消除各因素间的相互影响,根据这些确定的因素,确定正交表的因素的各个水平。根据各实验因素水平,取定容至250ml的浓缩液5ml,定容至100ml,用蒽酮比色法测其吸光度。由表2和极差分析可知碱溶性多糖的最佳提取方法是:1mol/L的NaOH溶液,提取6h,加1:25的碱液,提取4次。对多糖得率影响较大的因素是碱液的浓度和碱提的次数,其中以碱提次数影响较大,而碱提时间和加碱液的比例影响不大,且二者影响基本相同。3.3糖原测试3.3.1污染后在不同水溶液中还原糖含量的检测结果实验采用斐林试剂直接滴定法对葛仙米水溶性粗多糖还原糖含量进行了检测,检测结果如表3:由表3可以看出,葛仙米水溶性粗多糖中还原糖含量达0.42%。3.3.2仙米碱溶解粗多糖中还原糖含量的检测同样,实验采用斐林试剂直接滴定法对葛仙米碱溶性粗多糖中还原糖含量进行了检测,检测结果如表4:由表4可见:葛仙米碱溶性粗多糖中还原糖含量为0.57%。3.3.3对葛仙米多糖提取率的影响多糖含量=粗多糖-还原糖由表5可知:水溶性多糖的最高提取率是14.09%,碱溶性多糖的最高提取率是5.70%,水溶性多糖的提取率与碱溶性多糖相差较大,说明葛仙米中水溶性多糖的含量比碱溶性多糖高。3.4溴化钾压片与红外扫描法实验分别取水溶性多糖和碱溶性多糖10~20mg进行溴化钾压片,用傅利叶红外光谱仪在4000~500cm-1区进行红外扫描,结果见图3、图4。4在碱溶性葛仙米多糖中的应用4.4酶对多糖的提取率影响不大。4.5水溶性多糖和碱溶性多糖的组成有待今后进一步采用凝胶柱层析进行分析。多糖含量=粗多糖-还原糖图3、图4表明水溶性多糖和碱溶性多糖在4000~500cm-1内具有多糖性质的一般特征吸收:即3600~3300cm-1处为-OH和-NH2的吸收峰,3000cm-1左右为C-H的伸缩振动吸收峰,1600cm-1左右为的酰胺的振动峰1400cm-1左右为C-H的弯曲振动吸收峰,1000cm-1左右为吡喃环结构中C=O的吸收峰。但从图4、图5中可以看出,水溶性多糖与碱溶性多糖红外光谱图