黄芪多糖的提取及其铬络合物的制备及其降糖作用研究

黄芪多糖的提取及其铬络合物的制备及其降糖作用研究

糖又名多聚糖。糖的结构包含几个氨基酸，包括羧基（糖酸）和氨基（氨基糖）。这些氨基酸含有一个独对电子。根据化合物配位论，可以与金属离子形成化合物或嵌合物。黄芪多糖的分子量较大,约在10万道尔顿以上。在药理活性方面,有文献报道黄芪多糖能降低葡萄糖负荷,对抗肾上腺素引起的小鼠血糖升高。而三价铬离子是人体必需的微量元素,它是活性铬-葡萄糖耐量因子(glucosetolerancefactor,GTF)的组成成分,能协助胰岛素发挥降糖作用,促进机体碳水化合物、脂肪代谢的正常进行。将三价铬离子与黄芪多糖络合,目的在于产生协同作用,提高降糖活性。多糖络合物的研究有一些文献已报道过,并且集中在多糖铁配合物的研究:王凯平等报道了当归多糖铁的一些初步的理化性质;李玉贤等合成了大枣多糖铁配合物以及茶叶多糖铁配合物;裴晓红等研究了白芍多糖铁配合物的合成及其一般性质。他们将三价铁离子与多糖络合之后,制成一种新型的补铁剂治疗贫血症。既减少了由于直接补充铁而造成的胃部的刺激;同时也发挥了以上的这些多糖(当归多糖、大枣多糖、茶叶多糖、白芍多糖)治疗贫血症的作用,实验结果证实了多糖与金属铁离子产生的协同作用提高了治疗效果。本实验首次合成了黄芪多糖铬络合物,并将黄芪多糖与黄芪多糖铬络合物的降血糖作用作了初步比较。1材料和方法1.1动物ICR小鼠,雌雄各半,购于上海斯莱克实验动物有限公司。1.2特芬材料蒙古黄芪购于上海华宇药材总公司,产地为山西。1.3冲液溶液配制链脲佐菌素购于上海西宝公司。称取50m,以0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液4ml(pH4.5)配制成12.5mg/ml溶液。临用前配制。取两片格列本脲(上海信谊药业有限公司,批号031202,2.5mg/片),碾碎,加适量1%CMC,再加生理盐水至总体积10ml,配制成0.5mg/ml的混悬液备用。1.4红外光谱分析稳灵型血糖测定仪和稳灵型血糖试纸强生(上海)医疗器材有限公司;Brucker红外光谱分析仪EQUINOX55;UnicoUV-2102紫外-可见分光光度计。1.5方法1.5.1黄芪多糖的纯化将黄芪药材粉碎成粗粉,称500g加10倍量水回流提取4h,共三次,过滤,合并三次提取液,减压浓缩至1/10体积,加入5倍量95%乙醇,静置,有沉淀析出。抽滤,用无水乙醇、丙酮洗涤沉淀物,抽干即得粗多糖43g。将粗多糖用少量去离子水溶解,Sevag法除蛋白后,加3倍量的无水乙醇使之沉淀,离心,沉淀先后用无水乙醇、丙酮、无水乙醚分别依次洗涤沉淀物两次,真空干燥,得到棕黄色粉末12g,即为纯化后的黄芪多糖。紫外检测,280nm处基本无吸收,蛋白已被除去。苯酚-硫酸法测定黄芪多糖的含量为68%。1.5.2黄芪多糖铬络合物的制备取5g纯化后的黄芪多糖溶于100ml去离子水,70℃水浴搅拌,然后滴加2mol/LCrCl3和2mol/LNaOH,维持溶液的pH8~9。当溶液中刚出现绿色絮状沉淀时,停止加入NaOH和CrCl3,反应液继续70℃水浴保温1h。取出反应液,冷却,离心取上清液。于上清液中加入两倍量95%乙醇,出现大量沉淀,静置,离心,收集沉淀,用无水乙醇、丙酮洗涤,冷冻干燥。得到4g黄芪多糖铬络合物粗品。将该络合物粗品,用少量去离子水溶解后,用透析袋除盐。透析液经过浓缩后,再加入两倍量的95%乙醇,静置,离心,收集沉淀,无水乙醇、丙酮洗涤,冷冻干燥后得到2.5g纯化后的黄芪多糖铬络合物。络合物的形成必须要有中心原子和配体,周期表中绝大多数元素皆可作为中心原子,而配体必须提供至少一个孤电子对。黄芪多糖水溶液在碱性的条件下,糖上的羟基可以脱去质子,产生了孤电子对,从而能和三价铬离子进行配位络合。1.5.3基因组化的菌株和作/位的推测团KBr压片于红外光谱仪上分析黄芪多糖及其铬络合物的结构差异,推测发生配位的基团。采用紫外分光光度仪分析黄芪多糖、三氯化铬和黄芪多糖铬络合物水溶液在200~800nm波长区间的扫描图谱。Cr的含量由电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)测定1.5.4模型分组及给药剂量ICR小鼠禁食过夜,尾静脉注射链脲佐菌素125mg/kg,7d后测空腹血糖值,挑选血糖高于11.1mmol/L为高血糖模型。小鼠每日灌胃给药,连续给药7d。空白对照组小鼠正常饲养;模型组小鼠每日两次i.g生理盐水,每次0.2ml;阳性对照组小鼠每日两次i.g格列本脲。其他分组情况及给药剂量见表1,其中多糖给药剂量参考药典剂量标准,铬络合物剂量则按络合物得率推算确定。配药浓度为每10g小鼠体重0.1ml药液。末次给药后禁食8h,测定空腹血糖值。2结果与分析2.1黄棕榈叶糖的定性鉴定2.1.1《好氧指数法》治疗可能不适宜黄芪多糖铬络合物的得率为50%(相对于黄芪多糖)。它极易溶于水,不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。应用ICP-AES技术,黄芪多糖铬络合物中铬含量为6.28%。2.1.2氧化铬络合物的制备取少量黄芪多糖铬络合物溶于水,溶液澄清,无浑浊。而氢氧化铬溶在水中,呈现絮状沉淀。因而我们得到的黄芪多糖铬络合物中无氢氧化铬。游离的三价铬离子在透析的过程中被除去了,因而在黄芪多糖铬络合物中也无游离的三价铬离子。2.2黄棕榈酸铬化合物的光谱分析2.2.1合峰强度的影响从红外图谱(图1)可以看出黄芪多糖铬络合物在3400cm-1左右处的羟基伸缩振动(νO-H)的氢键缔合峰强度,比相应多糖的吸收峰有所减弱,且发生较大波数红移(从3404cm-1到3435cm-1),这是由于铬离子与羟基氧原子发生配位反应,导致羟基形成分子间和分子内氢键能力减弱。并且黄芪多糖铬络合物的红外吸收峰与黄芪多糖配位前相比,骨架特征峰未发生明显变化,因而推测三价铬离子与黄芪多糖的羟基形成了配位键。2.2.2价铬离子的配置体紫外光谱(图2)的结果显示黄芪多糖铬络合物中三价铬离子的最大吸收波长有红移现象,分别从392nm到410nm,542nm到563nm。而作为配体的黄芪多糖本身没有紫外吸收,可排除多糖的干扰,推测红移是由于三价铬离子的d轨道电子受到配位体的影响发生变化,产生跃迁使吸收谱带红移所致。从以上红外图谱和紫外图谱的变化可看出,反应后生成的产物与反应前多糖图谱相比出现了不同程度的变化,并且这种变化与文献报道表征络合物形成时的变化相符。因此,从以上定性反应以及图谱数据,可以推测三价铬离子与黄芪多糖发生了络合。2.3黄鼠尾草和化合物结合物对链辅助细胞菌素模型的影响2.3.1各给药前后小鼠体重的变化小鼠注射链脲佐菌素之后,明显呈现多食、多饮、多尿的症状。从表1中可以得出,模型组小鼠体重较空白组有明显的增加,说明造模的成功。而各给药组小鼠体重都呈现下降趋势,尤其是黄芪多糖铬络合物,在低、中、高三个剂量上,小鼠体重在给药后都与给药前有显著差异(p<0.05)。阳性对照药物格列本脲并不能降低高血糖小鼠的体重。2.3.2不同剂量组治疗的治疗效果从表2中可以看出黄芪多糖只有在低剂量组时,才表现出明显的降血糖作用。而黄芪多糖铬络合物在低、中、高三个剂量组都表现出降血糖作用,并且与给药前相比,均有显著性差异(p<0.05);而后者低剂量组也与给药前有显著性差异(p<0.05)。因此可以得出黄芪多糖铬络合物的降糖效果明显好于黄芪多糖。3价铬及其络合物对血糖的影响目前植物多糖的研究已经相当深入,有提取分离纯化,构型构象分析和药理活性筛选等方面的研究,但是多糖作为配体与金属形成络合物的研究比较少。一般研究络合物的结构都要获得能做X-射线衍射的单晶。但多糖的骨架较大,结构复杂,难以获得相应的晶体,从而在络合反应之后,不能直接确定络合的部位以及最终的结构式。但是我们可以通过图谱的数据推测其可能的结构。文献报道的多糖络合物结构多是通过一些检测手段(如红外光谱、紫外光谱、顺磁共振等)推测得到的。本实验将黄芪多糖经过纯化,去除了较多杂质(主要是蛋白质),为接下来的络合反应排除了蛋白质的干扰。在合成络合物之后,又通过透析的方法,去除了大部分的小分子杂质。虽然在实验中制备的络合物也没有直接得到明确的结构式,但从红外光谱和紫外光谱的数据的变化基本可以推测三价铬和黄芪多糖发生了配位反应,造成多糖的部分结构(主要是糖基上的缔合羟基)发生了相应改变,从而引起波数和波长的位移。通过实验初步观察了黄芪多糖及其铬络合物对于高血糖小鼠体重和血糖的影响,结果显示高血糖小鼠在给多糖铬络合物之后,体重和血糖均较给药前有降低,与给药前相比有显著性差异(p<0.05)。而单给多糖组只有在低剂量时才能表现出降血糖作用。文献报道,三价铬离子无明显的细胞的毒性。以无机盐形式(三氯化铬)给药后,因三价铬离子较难进入细胞中,降糖效果并不明显,而以络合物的形式给药有利于铬离子的吸收。而黄芪多糖铬络合物在给