益气酰胺汤对d-半乳糖衰老小鼠的抗自由基作用

益气酰胺汤对d-半乳糖衰老小鼠的抗自由基作用

虽然衰退不能抵抗，但它可以延迟，发现缺陷，科学地提出抗衰老的对策，是科学的先进水平。现代研究认为,自由基损伤是衰老的主要机制之一。中医中药在延缓衰老方面有着悠久的传统和独特的优势,历代医家提出了多种学说,脾虚衰老学说是其中最重要的一种。“补土派”的代表人物李东垣提出“内伤脾胃,百病由生”的论点。把“益气升阳法”做为补土的主要法则,而益气聪明汤是其代表方。临床中我们运用该方在治疗老年人头痛眩晕、脑动脉硬化、老年痴呆、耳鸣耳聋、白内障等常见病、多发病,并发现该方在缓解疲劳、增强记忆力等方面均取得良好疗效。提示益气聪明汤有良好的延缓衰老作用,但未见文献报道益气聪明汤延缓衰老的动物实验研究及其作用机理探讨,基于此,本实验采用D-半乳糖皮下注射建立衰老动物模型,从衰老发生的自由基学说角度探讨益气聪明汤延缓衰老的作用机理。1材料表面1.1实验动物及饲料健康昆明种小鼠60只,体重18-22g,2月龄,雌雄分养,自由摄取饲料(实验动物以及饲料均由湖南中医药大学实验动物中心提供,许可证号:医动字第20-002号)。D-半乳糖(Amresco公司);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程有限公司)1.2学养成药、药材、小剂量、现药的配制益气聪明汤按《东垣试效方》原方,由黄芪16g、人参16g、炙甘草16g、升麻10g、葛根10g、蔓荆子5g、白芍3g、黄柏(炒黄)3g组成,湖南中医药大学一附院药房提供药材,按传统方法煎煮过滤,并于恒温水浴锅中浓缩至∶大剂量:每毫升含生药1.35g;中剂量:每毫升含生药0.675g;小剂量每毫升含生药0.3375g;4℃冰箱保存备用。维生素E胶丸(100mg/粒),市购,广州白云山制药总厂(批准文号:国药准字H44021557)。2方法2.1模型2:不同剂量组患者的群60只小白鼠按随机分为6组,每组10只,雌雄各半,分别为∶正常组,D-半乳糖模型组,益气聪明汤大剂量组27g/(kg·d)、中剂量组13.5g/(kg·d)、小剂量组6.75g/(kg·d),维生素E对照组VitE50mg/(kg·d)。在造模的同时,模型给药组分别灌胃相应浓度药物0.2ml/(10g·d);正常对照组、D-半乳糖模型组灌胃0.2ml/(10g·d)的生理盐水。第42天做各项指标检测。2.2小鼠衰老模型参照文献和造模预实验结果,除正常对照组外,其余各组均无菌操作颈背部皮下注射5%D-半乳糖生理盐水0.25ml/(10g·d),每天一次,连续42天,造成小鼠衰老模型。同时正常对照组无菌操作颈背部皮下注射0.9%的生理盐水0.25ml/(10g·d)。2.3观察指标和测试方法2.3.1血清采集实验(1)实验中小鼠一般情况的观察观察小鼠精神、活动、皮毛光泽及皮肤弹性、饮食饮水量、大小便;(2)血清采集实验第42天,用10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔麻醉后,分离出颈动脉,剪断取血,用台式离心机离心10分钟,吸取血清,做好标记,-20℃保存待测;(3)血清SOD、MDA的检测均按照试剂盒说明书进行操作。2.3.2检测方法(1)SOD活性的检测采用黄嘌呤氧化酶法;(2)MDA含量的检测采用硫代巴比妥酸(TBA)法。2.4处理数据的方法用SPSS11.5统计软件进行数据处理,实验结果以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。3结果3.1对小鼠的性能正常组小鼠精神好、行动敏捷、毛发光泽、皮肤弹性好、大便为成形黄褐便,无腥臭。模型组小鼠精神萎靡、行动迟缓、毛色枯槁、皮肤弹性差、大便溏,有腥臭。余组小鼠上述表现较模型组有良性逆转。益气聪明汤大剂量组较正常组小鼠外形无变化,活动如常,摄食可,大便为深褐色软便。除正常组和大剂量组之外,余组均有小鼠死亡,模型组死亡2只,小、中剂量组及VitE组各死亡1只。3.2对血清sod活性的影响如表1所示:与正常组比,模型组、VitE对照组、小、中剂量组血清SOD活性显著降低(P<0.01);但大剂量组与正常组比无明显差异(P>0.05)。小、中、大剂量组与模型组比显著升高(P<0.01);VitE对照组与模型组比明显升高(P<0.05)。四个治疗组之间比较:VitE对照组与小剂量组之间无明显差异性(P>0.05);中剂量组显著高于VitE对照组(P<0.01),也明显高于小剂量组(P<0.05);大剂量组显著高于小剂量组、VitE对照组(P<0.01),也明显高于中剂量组(P<0.05)。由此可见:益气聪明汤三个治疗组均能有效升高血清SOD的活性,且升高幅度与其剂量呈正相关。VitE对照组也能有效升高血清SOD的活性,但益气聪明汤大、中剂量组要优于VitE对照组。3.3对血清mda含量的影响如表2所示:与正常组比,模型组、VitE对照组、小、中剂量组MDA含量显著升高(P<0.01);大剂量组与正常组比无明显差异(P>0.05)。四个治疗组与模型组比显著降低(P<0.01);四个治疗组之间比较:VitE对照组与小剂量组之间无明显差异性(P>0.05);中剂量组显著低于VitE对照组(P<0.01),也明显低于小剂量组(P<0.05);大剂量组显著低于小剂量组、VitE对照组(P<0.01),也明显低于中剂量组(P<0.05)。因此益气聪明汤三个治疗组均能有效降低血清MDA含量,且降低幅度与其剂量呈正相关。VitE对照组也能有效降低血清MDA含量,但益气聪明汤大、中剂量组要优于VitE对照组。4有关抗氧化能力的测量东垣脾胃学说是中医发展史上的一个里程碑,他认为“元气之充足,皆由脾胃之气无所伤,而后能滋养元气。若胃气之本弱,饮食自倍,则脾胃之气既伤,而元气亦不能充,而诸病所由生也”,把益气升阳法作为补土的重要原则,益气聪明汤是益气升阳法代表之一,全方黄芪、人参为君,益气升阳;用葛根、升麻为臣升举脾胃清阳,君臣合用,益气升阳举陷。佐以白芍、蔓荆子养肝明目,蔓荆子兼清利头目;黄柏泻火坚阴,又防葛根、升麻升发太过;使以炙甘草,益气和中,调和诸药,合用则中气充足,清阳上升,浊阴得降,九窍通利,耳聪目明。主治“饮食不节、劳役形体,脾胃不足,得内障、耳鸣,或多年目昏暗、视物不能”,并云,“此药能令目广大,久服无内外障、耳鸣、耳聋之患,又令精神过倍,元气自益,身轻体健,耳目聪明”。临床中,我们运用益气聪明汤治疗老年人常见病、多发病往往取得良好疗效。衰老的机制学说众多,美国科学家Harman1955年提出衰老的自由基学说虽只是其中之一,但因它与其他学说有着直接或间接的关系,得到众多实验的支持,被广大学者所公认,所以成为诸多学说的中心。自由基是单独存在的、具有不成对电子的分子、原子、离子和基团,其本身极不稳定,具有高度的反应活性,它在细胞代谢过程中连续不断地产生,广泛地参与机体的生理与病理过程。机体内同时存在着自由基清除系统,其可以最大限度地防御自由基的损伤,自由基清除系统包括酶促反应和非酶促反应两部分。酶促反应所需酶有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等。非酶促反应的作用物质主要为一些抗氧化剂,主要有维生素E等。在正常情况下,自由基的产生和消除处于平衡状态,而衰老时,自由基的产生增多,清除减少,过多的自由基在体内蓄积,表现为SOD、GSH-PX含量下降,而丙二醛(MDA)和脂褐素(LF)的含量上升,过量的氧自由基破坏了细胞及其重要成分,引起膜功能减退,蛋白质和酶变性,DNA分子链断裂或交联等损伤,是加速衰老的重要因素。因此,消除体内多余的自由基,可延缓衰老的过程。长期以来,SOD被作为衰老与抗衰老研究的经典指标。衰老时SOD的变化与机体寿限呈正相关关系,SOD活性低下,寿命变短,而SOD回升,有利于增加寿限。因此,提高衰老机体中SOD水平,对于抗衰延寿无疑有重要价值。MDA是脂质过氧化终产物之一,MDA含量高低反映氧自由基水平和过氧化反应的强度和速率,是了解自由基导致机体组织、细胞损伤程度的重要指标。MDA与蛋白质、核酸及某些磷脂交联形成Schiff碱,累积形成脂褐素(LF),LF形成后可占据细胞空间,使细胞结构呈退行性改变,加速细胞老化过程。同时LF的聚集又反过来影响线粒体的功能,使活性氧的生成进一步增加,从而形成恶性循环。因而测定MDA的含量常常可反映机体内脂质过氧化的速率或强度,可以间接反应细胞受损害的程度,是公认的衰老指标。因此,本实验选用SOD、MDA作