阴虚证糖尿病模型的建立

阴虚证糖尿病模型的建立

糖尿病是一组以慢性糖水平升高为特征的代谢疾病。主要特点是血糖过高、糖尿、多尿、多饮、多食、消瘦、疲乏,发病率极高。据权威部门介绍目前我国糖尿病患者总数已居全球第2位,而且全国糖尿病患病率成倍数增长,形势十分严峻。中医学认为糖尿病(消渴)的重要病机特点在于阴津亏损,燥热偏盛,而以阴虚为本,燥热为标。祖国医学在千百年的发展中积累了治疗糖尿病的独到经验,因此,建立糖尿病中医证候模型,可为中医临床上能够有效地治疗糖尿病提供更多更有力的依据。本实验旨在建立一种更符合中医临床辨证、重复性和稳定性好的阴虚证糖尿病动物模型。1材料表面1.1实验动物及饲料大鼠,32只,雌性,体质量180~210g,由上海斯克莱实验动物公司提供。大鼠分笼饲养,置于温度(25±2)℃,湿度50%~60%的饲养室。每日光照8h。饮水为高温灭菌水,饲料为常规饲料。动物均自由饮水、进食。1.2材料、注射液和仪器甲状腺素(Thyroxin):长城药业有限公司产品,批号H31022151。链脲佐菌素(streptozotocin,STZ):西格玛奥里奇公司产品,批号87k1403。pH4.2的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液:以无菌0.1mol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液在冰浴中新鲜配制,然后调pH值至4.2,然后用直径22μm微孔滤膜过滤灭菌。胰岛素注射液:上海第一生化药业有限公司产品,批号H31020519,4℃冷藏保存。当模型大鼠的空腹血糖超过16.8mmol/L时,连续2d皮下注射胰岛素4u,超过21mmol/L时,皮下注射量为8u,连续2d。250g/L葡萄糖溶液:当大鼠血糖<2.8mmol/L时,予大鼠灌胃适量的250g/L葡萄糖注射液。血糖仪:德国罗康全活力型血糖检测仪,型号GN10215518,注册号:2400925。电子体温计:欧姆龙(大连)有限公司产品。型号MC-145,注册号22000070。2模型建立及检测2.1实验动物分组大鼠随机分为对照组(13只)、模型组(19只)。2.2模型复制动物购入后,先适应性饲养5~7d,待动物适应饲养室环境,体质量开始增加时进行实验。模型组大鼠先皮下注射甲状腺素,连续7d,用量为每日0.2mg/kg。实验第8天,禁食12h后,空腹腹腔一次性注射STZ。注射时,STZ先用pH4.2的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液溶解,配成20g/L的溶液,注射剂量50mg/kg,30min内注射完毕。对照组大鼠先皮下注射9.0g/L氯化钠注射液,连续7d,然后一次性空腹腹腔注射pH4.2的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液,剂量均与模型组相同。2.3标本采集及检测2.3.1观察项目:动态观察大鼠体质量、食量、饮水量、尿量、神态、被毛、活动度、粪便,体温等。2.3.2检测项目:大鼠血糖、尿糖、尿蛋白、肝肾功能等。模型复制后48h,剪大鼠鼠尾取血,用罗氏血糖仪测空腹8h后的血糖,此后每周1次剪尾测空腹血糖。模型复制后48h,将大鼠放入代谢笼,收集其24h尿液,进行尿糖、尿蛋白检测。每周1次。在模型复制后第3周,大鼠禁食8h后,用30g/L戊巴比妥钠按30mg/kg空腹腹腔注射,大鼠麻醉后解剖胸腔,心脏取血,检测肝功能和肾功能。2.4注意事项STZ要干燥避光-20℃保存,受潮后30min水解,故STZ要临用前配制,大鼠腹腔注射时,动作要快。注射STZ后6~10h,由于大鼠胰岛β细胞破坏,大量胰岛素释放,使血糖显著降低,动物可产生惊厥、死亡,故应在此期间监测血糖,并给予250g/L葡萄糖灌胃进行预防,以降低病死率。2.5统计学方法所有数据应用SAS6.12统计软件处理,结果以“x¯±sx¯±s”表示。数据呈正态分布时,影响因素间比较采用两因素析因设计的方差分析,组间均数比较采用t检验和方差分析;数据呈偏态分布时,采用符号秩和检验进行组间检验,P<0.05为差异具有统计学意义。3结果3.1大鼠粪便色,形态符合对照者一般资料对照组生长发育良好,体质量处于平稳增长状态;而模型组大鼠体质量下降明显,发育迟缓。对照组大鼠的食量、饮水量、尿量与实验前相比无显著变化,一直处于正常水平;模型组大鼠呈现明显的“三多一少”症状,食量增加但体质量下降明显,饮水量和尿量是对照组的2倍以上,同时尿色加深。模型组大鼠粪便颜色较对照组为深,干硬粒小。对照组大鼠精神状态良好,被毛洁白有光泽;模型组被毛粗糙发黄,黯淡无光泽,早期活动频多,烦躁、多动、易怒,后期则变得精神萎靡,反应迟钝。用电子体温计测量大鼠口腔温度,模型组体温比对照组平均高0.8℃。至实验结束,模型组大鼠死亡4只,对照组全部成活。模型复制成功后,使用罗氏活力型血糖仪剪尾测大鼠空腹血糖。对照组大鼠血糖在正常范围内,少波动。模型组大鼠空腹血糖均大于11.1mmol/L,随着时间推移,波动不大,始终维持在11.1mmol/L。见表1。3.2两组大鼠的尿糖和尿蛋白比较与对照组比较,模型组尿糖和尿蛋白均显著增高(P<0.05)。见表2。3.3ast、alp、尿素氮、尿酸检测与对照组比较,模型组谷丙氨酸转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartateaminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、肌酐、尿素氮和尿酸显著增高(P<0.05)。见表3。4t4模型的复制按国际糖尿病联盟(internationaldiabetesfederation,IDF)通过的糖尿病分型方案将糖尿病分为1型(胰岛素依赖型)和2型(非胰岛素依赖型)。1型糖尿病发病时“三多一少”症状较明显,与中医学中论述的“消渴”相似。因此本研究所探讨的糖尿病阴虚模型是以1型糖尿病为基础的。关于用STZ诱发大鼠糖尿病模型,已经有很多文献报道过。STZ是一种药效强大的烷化剂,能够干扰葡萄糖的转运,影响葡萄糖激酶的功能,诱导DNA双链断裂,是能够导致DNA和线粒体破坏的细胞毒性物质。大量文献报道STZ对β细胞有特异杀伤作用,通过种种可能的机制,致胰岛β细胞损伤。采用不同的给药方法,可复制出速发型和迟发型两种糖尿病动物模型。笔者介绍的方法属于速发型,通过较大剂量的STZ一次性注射来减少胰岛β细胞的合成与分泌。所形成的糖尿病模型倾向于1型糖尿病表现,“三多一少”症状较明显。大鼠对STZ毒性的敏感性较高,且大鼠体型较大,易于操作,耐受力较强,价格也比较低廉,故本研究选用大鼠作为模型动物。中医学对阴虚证的描述为精血或津液亏损而导致的病理现象,多见于劳损久病或热病之后而致阴液内耗的患者。临床表现多为五心烦热、头晕耳鸣、腰膝酸软、骨蒸潮热、两颧潮红、口干舌燥、溲黄便干、盗汗遗精、舌红少苔等阴虚内热的症状。阴虚证动物模型复制方法有多种。笔者采用甲状腺素复制模型的优点在于实施操作方便。甲状腺素主要是由猪、牛、羊等食用动物的甲状腺体制成,用于各种原因引起的甲状腺功能减退。正常人服用会引起心动过速、头痛、兴奋不安、失眠、肌无力、震颤、出汗、潮热、怕热、体质量减轻等类似阴虚的症状。实验发现,用T4复制模型后的动物表现及各种生化指标变化与“甲亢”的临床表现相似,而且采用滋阴中药治疗后症状得到改善,反证