猪源大肠杆菌的分离及其耐药性分析

猪源大肠杆菌的分离及其耐药性分析

猪病是影响仔猪生长发育的常见疾病。这是由死亡性肠球菌引起的疾病的总称，包括仔猪黄、白腹泻、水肿病和严重的并发症和死亡率。防治大肠杆菌病的常用方法是在饲料中添加大量的抗生素进行预防和控制,但随着抗菌药物长期、大量的应用,常常导致猪场环境中大肠杆菌耐药菌株产生;而细菌的耐药性可通过多种途径进行传播,如耐药基因可通过畜禽产品传导给人类菌群,引起交叉耐药,严重威胁着人类的健康。大肠杆菌的耐药机理十分复杂,也一直是研究者们关注的热点,特别是近年来随着分子生物学和基因工程技术的发展和应用,其耐药机制逐渐得以阐明,包括外源耐药基因的获得、主动外排系统、灭活酶和钝化酶的产生、药物作用靶位点的改变等,其中以耐药质粒的接合和转导作用最为普遍。笔者在前期的工作中,从贵州省6个规模养猪场的污水、土壤和粪便样本中分离出了多株大肠杆菌,本试验在此基础上通过药敏纸片法检测其耐药性,采用PCR法检测其qnrA和aac(6’)-Ib耐药基因,并通过质粒消除试验探讨其耐药机制,以期为养猪场大肠杆菌病的防控提供理论依据。1材料和方法1.1菌株及测定菌株药敏试验菌株:随机选取从规模养猪场的污水、粪便和土壤样本中分离鉴定的大肠杆菌31株;大肠杆菌药敏标准菌株ATCC25922购自中国兽医药品监察所。耐药基因检测菌株:随机选取从规模养猪场的污水、粪便和土壤样本中分离鉴定出的大肠杆菌56株;qnrA和aac(6’)-Ib基因阳性对照菌株由贵州大学动物科学学院药理学实验室吕世明老师惠赠。1.2培养基和药物敏敏纸普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基和20种药敏纸片:杭州微生物试剂公司产品。1.3主试剂TaqDNA聚合酶等PCR反应试剂:大连宝生物工程有限公司产品。1.4猪环境中对唑酮的抗药性采用药敏纸片琼脂扩散法对大肠杆菌进行药物敏感性试验,通过抑菌圈大小判断细菌对药物的敏感性。判定标准由杭州微生物试剂有限公司提供。1.5引物的设计以提取的大肠杆菌质粒DNA为模板进行PCR扩增。参照GenBank中的已知序列设计了2对引物,退火温度和预期产物大小见表1。将阳性菌株的PCR产物送往大连宝生物工程有限公司测序。1.6耐药质粒消除和药敏试验参考文献的方法进行,将1株aac(6’)-Ib基因阳性菌株采用高温-SDS法进行耐药质粒消除,并用药敏纸片琼脂扩散法检测耐药性的变化。分别将耐药质粒消除菌株在含20μg/mL卡那霉素的LB培养基中传代培养,每间隔2代进行一次药敏检测,跟踪其耐药性的变化;同时接种于不含卡那霉素的LB培养基中,按5代间隔做药敏试验。2结果2.1素、四环素、环环素、红霉素和罗红霉素的耐药情况随机选取不同来源的31株大肠杆菌进行药物敏感性试验,结果发现,标准质控菌结果可靠,在20种抗生素中,以青霉素、四环素、红霉素、洁霉素和罗红霉素的耐药率最高,分别为96.8%(30/31)、93.5%(29/31)、90.3%(28/31)、96.8%(30/31)和83.9%(26/31);污水、粪便及土壤中的大肠杆菌耐药率分别为58.5%、44.2%、45.8%,可见污水源菌株的耐药率最高,其次为土壤样本中的菌株(见表2)。2.2bp左右的条带对56株大肠杆菌进行qnrA及aac(6’)-Ib基因的PCR扩增,结果显示,qnrA基因检测中未出现582bp左右的条带(见图1);而对菌株aac(6’)-Ib基因的PCR扩增中,试验菌株有8株出现481bp左右的条带,阴性对照未出现条带,其中污水样本的aac(6’)-Ib基因扩增阳性率为13.0%(3/23)、粪便样本为21.1%(4/19)、土壤样本为8.3%(1/12),结果见图2。2.3aac6’-ag-cr基因将阳性菌株的PCR产物回收后测序并进行序列分析,结果显示E.coli1、E.coli2、E.coli3、E.coli4、E.coli6、E.coli7、E.coli8分别在第223位(T→C)或第454位(G→T)碱基发生突变,经鉴定,均携带aac(6’)-Ib-cr基因(见表3)。2.4高温和sds处理质粒电泳图谱将1株携带aac(6’)-Ib基因的耐药菌株进行质粒消除。经过反复的高温和SDS处理后,质粒电泳图谱显示质粒条带逐渐减少,且大质粒丢失严重。PCR检测结果显示不携带aac(6’)-Ib基因,耐药质粒成功消除(见图3)。2.5耐药质粒消除菌株的药敏试验用氨基糖苷类(卡那霉素、庆大霉素、新霉素、丁胺卡那霉素)和喹诺酮类(左氧氟沙星、恩诺沙星、氟哌酸、环丙沙星)对耐药质粒消除菌株进行药敏试验,结果显示对8种氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素的耐药性消失,所有菌株都转变为中度敏感和敏感,其中卡那霉素和诺氟沙星的抑菌圈变化最大,结果见图4。2.6细菌耐药性变化耐药质粒消除菌株分别在LB液体培养基中连续传20代后,药物敏感性没有发生变化。将其在含20μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中连续传代,药敏试验结果显示,经在含卡那霉素的LB培养基中传代后,细菌的耐药性上升。卡那霉素到第4代出现耐药性,庆大霉素到第6代出现耐药性,丁胺卡那霉素到第6代出现耐药性。表明耐药性消除菌株在没有抗生素筛选压力下可稳定生存,但施加抗生素后还会再次诱导出耐药性。3耐药基因及耐药机理大肠杆菌主要寄居于人和动物的肠道内,但由于活动的广泛性,使其在污水、粪便和土壤等环境中都有不同程度的存在。该菌属于条件病原菌,有些血清型能引起人和动物的中毒和感染,并导致疾病的暴发和流行。因此,由大肠杆菌引发的疾病已成为十分重要的全球性公共卫生问题,其多重耐药性也已引起高度重视。笔者所在实验室于2009-2010年间对贵州省猪场环境中大肠杆菌进行了调查,发现粪便和污水样本中大肠杆菌的分离率较高,分别为75.0%、54.4%,可见动物肠道提供了大肠杆菌生长和繁殖的良好场所。对随机选取的31株大肠杆菌进行药敏检测,发现不同地区、不同来源分离到的菌株对药物的敏感性存在较大差异,耐药性随着建场时间的延长而逐渐增强。大肠杆菌对20种临床常见药物的平均耐药率达50.5%,其中90.6%的菌株耐7种以上的抗生素。丁胺卡那霉素和左氧氟沙星的耐药率均在10%以下,可作为治疗猪大肠杆菌病的首选药。在对耐药基因qnrA和aac(6’)-Ib的检测中,56株大肠杆菌均未携带qnrA基因,可见qnrA基因在贵州省猪场环境中的流行分布较少;而aac(6’)-Ib的检出率为14%(8/56),阳性菌株分别为来自粪便的样本4株,污水样本3株,土壤样本1株。由于抗生素在防治肠道疾病中的滥用,使肠道成为耐药基因产生的起点,粪便没经过任何处理,水冲式的清粪方法使携带耐药基因的菌株散播到土壤和污水等猪场周边环境中。因此,猪场工作人员应及时清理粪便和污水并做好无害化处理,防止细菌的耐药性随着耐药基因而传播。测序分析后,将含变异体aac(6’)-Ib-cr基因的菌株进行药敏试验,发现该菌株可介导对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素的广泛耐药性。本试验所用的耐药性消除菌株对20种抗生素都不敏感,尤其是喹诺酮类药物。喹诺酮类在治疗肠道细菌感染中具有抗菌谱广、价格低廉、作用强等优势,因而被广泛用于临床治疗,其耐药性的产生将严重影响人医及兽医临床治疗。本研究在应用高温-SDS法消除质粒的过程中,通过PCR检测耐药基因及药敏试验检测耐药性的消除情况。结果显示,大肠杆菌的部分耐药性是由质粒携带的耐药基因决定的,随着耐药质粒的消除,细菌的耐药性也被逆转。因此,开发新型的质粒消除剂对临床上耐药菌株的防治具有重大意义。在耐药质粒消除的过程中,发现质粒DNA条带减少,然而PCR检测耐药质粒并没有消除。原因可能是在高温和SDS处理的菌液里存在质粒消除菌株,也含有质粒未消除的原始菌株。可见高温和SDS处理同一种菌株的效果不完全,某些菌逃避了高温和消除剂的作用。同时发现,耐药消除菌株连续传20代,其药物敏感性无明显变化,可见耐药性消除状态是稳定的,但在抗生素存在下,细菌又会重新迅速获得耐药性,通过PCR检测发现耐药基因aac(6’)-Ib不可修复,其耐药机理有待进一步研究。大肠杆菌的耐药性在抗生素