糖尿病大鼠缺血性心脏病模型的制备

糖尿病大鼠缺血性心脏病模型的制备

根据2007年至2008年中国科学和文化发展研究所的流行病学研究，20岁以上的中国青年糖尿病患者数量为9.7%，约14200万人。糖尿病(diabetesmellitus,DM)已成为我国必须面对的公共卫生问题。DM长期代谢异常能够引起多种并发症,其中,冠状动脉病变及其引起的缺血性心脏病已经成为糖尿病人死亡的主要原因。目前,多采用结扎冠状动脉前降支制备糖尿病心肌缺血模型,但是该模型为心肌的急性损伤模型。而DM为慢性代谢性疾病,其并发的缺血性心脏病也是一个缓慢致病的过程。因此,制备慢性2型糖尿病大鼠心肌缺血模型,对于其机制的研究具有重要意义。在本研究中我们采用高糖高脂饮食联合注射STZ制备的2型糖尿病大鼠,观察其是否会发生糖尿病缺血性心脏病,为糖尿病缺血性心脏病的研究提供理想的动物模型。1材料和方法1.1f级饲养环境适应周期6周龄雄性SPF级Wistar大鼠,体重(150.2±7.2)g,购于军事医学科学院实验动物中心。SPF级饲养环境适应一周,环境温度为20～25°C,12P12h昼夜规律。随机将大鼠分为2组:正常组(Control)10只;糖尿病模型组(DM)10只。正常组饲喂正常饲料,糖尿病模型组饲喂高糖高脂饲料,即由基础饲料按比例添加蔗糖,炼猪油和蛋黄搭配制作(蔗糖20%,猪油10%,蛋黄10%,基础饲料60%)。1.2实验试剂与仪器链脲佐菌素(streptozoticin,STZ,Sigma,USA),柠檬酸钠缓冲液(Solarbio),大鼠胰岛素Elisa试剂盒(上海西塘科技有限公司),大鼠心肌肌酸激酶试剂盒、大鼠心肌乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所),强生稳豪倍易型血糖仪及配套试纸(强生),高速低温离心机(Thermo,USA),指针型三用电热恒温水浴箱(北京市长风仪器仪表公司),BL-410生物机能实验系统(成都泰盟),SpectraMaxM3多功能酶标仪(MolecularDevices,USA)。1.3大鼠的一般情况,血糖高、体重和血糖糖尿病模型组给予高糖高脂饮食4周后,一次性腹腔注射40mg/kgSTZ(溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液,pH4.5)。正常组给予正常饮食4周后,腹腔注射等量柠檬酸缓冲液。注射STZ48h后测空腹血糖,空腹血糖值>11.1mmol/L的大鼠为造模成功。1.4大鼠的体重和血糖测定每周常规检测体重,连续14周。每周定期检测血糖,连续14周。空腹8h后,剪尾法采血,强生血糖仪测定大鼠空腹血糖值。1.5血清分离时间每周鼠尾静脉采集血液,4℃离心,3000r/min,15min,分离血清,-20℃保存,连续14周。采用酶联免疫吸附法,使用SpectraMaxM3多功能酶标仪测定血清胰岛素的含量。1.6心电图监测糖尿病模型组大鼠和正常组大鼠每周定期心电图监测,连续14周。麻醉,固定,使用BL-410生物机能实验系统,测定肢体2导联心电图。1.7血清去清2.3.2在第14周测心电图后,各组大鼠腹主动脉采血。室温静止30min,3000r/min离心15min后,分离血清,-20℃冻存备用。按试剂盒说明书,使用SpectraMaxM3多功能酶标仪测定血清中肌酸激酶和乳酸脱氢酶的含量。1.8统计分析实验数据以均值±标准差(±s)表示,所有数据使用SPSS16.0统计软件分析处理,组间比较采用独立样本t检验。2结果2.1糖尿病模型大鼠血糖变化前4周,糖尿病模型组大鼠的血糖与正常组相比,没有明显差异(P>0.05)。在第4周结束时,注射STZ后,糖尿病模型组血糖值迅速升高,达到17.9mmol/L,与正常组之间血糖值具有显著差异(P<0.05),随后糖尿病模型组大鼠的血糖处于较高水平,波动在16.3mmol/L～18.7mmol/L之间(图1)。2.2脂放养时间对脂喂胰岛素水平的影响从胰岛素水平的变化来看,高糖高脂饲喂的大鼠,在第2周时开始升高,随着高糖高脂喂养时间的延长,胰岛素水平在不断提高,在第4周胰岛素水平达4.05ng/ml,与正常组比较具有显著差异(P<0.05)。当注射STZ后,胰岛素含量迅速下降到1.92ng/ml。正常大鼠血清胰岛素含量未有明显变化(图2)。2.3血糖、体重变化高糖高脂喂养组大鼠体重迅速增加,在第2周,与正常组大鼠体重之间有显著差异(P<0.05)。第4周后,随血糖进一步增加,体重增加幅度减小。第8周达到397g后,体重出现下降的趋势,至12周,体重为387g,显著低于正常组大鼠体重67g(P<0.05,图3)。此外,大鼠出现多饮、多食、多尿等症状,精神萎靡等糖尿病症状。2.4大鼠心肌缺血糖尿病模型组第14周大鼠心电图,2导联心电图出现S-T段抬高,提示,糖尿病模型组大鼠心肌缺血。而正常大鼠,未出现S-T段抬高(图4)。2.5型组大鼠血清中的ck、ldh含量第14周,与正常组大鼠比较,糖尿病模型组大鼠血清中的CK含量升高至691U/L,且有统计学意义(P<0.05),LDH也明显升高(P<0.05,表1)3高糖高脂饮食联合注射对大鼠心电图的影响本实验中,采用高糖高脂饮食联合注射STZ复制2型糖尿病动物模型。高糖高脂饮食饲喂4周,胰岛素分泌代偿性增加,血糖值未有明显变化。STZ能够选择性破坏大鼠的胰岛β细胞,导致胰岛素分泌不足。腹腔注射STZ48h后,胰岛素含量下降,血糖升至17.9mmol/L,大鼠空腹血糖>11.1mmol/L,提示大鼠糖尿病模型复制成功。DM为慢性代谢性疾病,长期代谢异常能够引起心血管病变,其引起的缺血性心脏病,成为DM病人死亡的主要原因。通常采用结扎糖尿病大鼠左冠状动脉前降支来模拟临床心肌缺血,这种人为施加的干预为急性损伤,而DM为缓慢致病的过程。本实验复制的2型糖尿病大鼠模型后,每周定期监测糖尿病模型组大鼠心电图的变化,发现第14周时,糖尿病模型组大鼠的2导联心电图S-T段明显抬高,提示心肌缺血。CK和LDH广泛存在于心肌细胞胞浆中,心肌细胞受损后,其释放到血液中,含量增加。检测其在血清中的含量,可以反应心肌受损程度。本实验长期高血糖引起心肌细胞损害,CK也升高。与正常组比较,糖尿病大鼠血清CK含量升高至691U/L,LDH升高至3.54×