链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠认知功能损伤及海马神经元细胞凋亡的研究

链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠认知功能损伤及海马神经元细胞凋亡的研究

糖尿病病房的发病机制糖尿病是一种全身代谢障碍的综合性疾病。长期代谢障碍将导致眼、肾、心脏和神经系统损伤。其中,糖尿病脑病是一种常见的与中枢神经系统退行性病变和功能损伤相关的糖尿病并发症。在1922年便有报道糖尿病能够引起认知功能损伤,随后的大量研究表明这种认知的损伤在Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病中都有发生。研究发现,糖尿病脑病患者出现严重的认知功能障碍和不同程度生活自理困难,并且由糖尿病引发的痴呆比其他原因引起的痴呆发病率更高。临床症状主要表现为学习、记忆、解决问题和运动反应速度能力等障碍。目前认为糖尿病脑病的发病机制可能是糖尿病患者长期的高血糖引起脂质代谢紊乱,血液黏稠度不断升高,血管壁狭窄,最终造成脑部血供应不足,从而诱发与认知有关的脑神经元细胞损伤。研究发现,随着发病时间的延长,与认知相关的海马CA1和CA2区神经元细胞发生凋亡,进而表现出认知下降。糖尿病脑病的发病机制已受到越来越多的人关注,但由于患者脑标本难以获得,因此把实验动物作为研究糖尿病脑病发病机制和药物治疗机制的模型已成为当前研究的主要手段,科学实验和临床研究迫切需求成熟的糖尿病脑病动物模型。由于糖尿病脑病主要表现为学习和记忆等功能障碍,形态学检查也发现患者海马神经元细胞凋亡或丢失,因此本研究从学习记忆能力以及与认知相关的海马神经元细胞形态变化的角度对链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病脑病大鼠进行研究。首先通过腹腔注射STZ构建糖尿病大鼠模型,进一步检测和观察糖尿病大鼠发病后不同病程时间的血糖、体重、行为学和海马神经元细胞形态学表现,对糖尿病脑病的发病情况进行探讨,为糖尿病脑病的进一步药物试验提供指导依据。1材料和方法1.1试剂和试剂STZ购自Sigma公司,苏木精和伊红购自北京中杉金桥生物技术有限公司,多聚甲醛购自北京化学试剂公司,其他试剂均为国产分析纯试剂。快速血糖检测血糖仪购自上海新立生物技术公司,荧光倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司,旋转式薄片切片机购自德国莱卡公司,Y迷宫购自中科院上海生理所。1.2糖尿病大鼠造模实验和分组Wistar大鼠购自大连医科大学实验动物中心,2月龄,体重230~250g,雄性,适应一周之后,经Y迷宫筛选除去认知过于敏感或迟钝的大鼠。糖尿病造模:一次性腹腔注射STZ(60mg/kg),给药后分别在第3天和第7天2次检测血糖,空腹血糖≥11.1mmol/L为造模成功,未成模者除去,给药后第8天记作糖尿病发病第1天,最终取90只成功造模大鼠进行实验。以90只造模成功的大鼠作为糖尿病组进行实验,共分为9组,每组10只,分别在第20、30、40、50、60、70、80、90、100天进行检查。另取10只正常大鼠注射相应剂量生理盐水作为对照组。各组大鼠分笼饲养,温度为(24±1)℃,自由进食进水,12h光照。所有动物进行血糖、体重、Y迷宫测试,然后处死、取脑、固定、染色、细胞计数观察。1.3下一次正确率2.鼠具有喜暗避明习性,Y迷宫的工作原理就是通过对鼠明暗辨别特性学习记忆能力考查来评价其认知能力。Y迷宫的实验操作条件为:40V直流电电压,0.7mA电流。具体步骤为:首先将大鼠放入其中一个臂箱,适应2min,随机开启另外两个臂箱中的一个信号灯,短时间后如果大鼠一直停留在暗处或者跑到另外一黑暗处,就会遭到足底电击,最终跑到亮灯的安全区域一次学习完成。间隔2min,进行下一次训练。检测要求为:大鼠由所在区域直接跑向安全区即为学习正确。每日训练20次,直到正确率连续达80%为学会。记录训练次数、训练天数、错误的次数和反应时间(到达安全区的时间,单位为s)。1.4苗木精-伊红染色大鼠进行乙醚深度麻醉,安乐处死,在冰台上快速取出全脑,冰冷生理盐水中洗净组织表面血液,4%多聚甲醛固定48h(4℃保存),随后用石蜡进行包埋,切片(厚度6μm),进行苏木精-伊红(HE)染色。具体操作步骤:固定,脱水,苏木精染色5min,分化,冲洗,再伊红染色,酒精梯度脱水,透明,封片,400倍镜下观察。海马神经元细胞计数方法:以海马组织齿状回上下侧分支末端连线延长与海马CA1区交界为中点,沿海马神经元走向以交界中点为中心,向两方向各延长0.5mm,取海马CA1区细胞1mm长度作为实验计数范围,进行计数并照相。1.5统计学分析所有实验数据以均数±标准差(ue0af±s)表示,用统计学软件SPSS13.0进行统计学分析,组间均数采用t检验进行比较,当P<0.05,认为差异具有统计学意义。2结果2.1发病20d以上的糖尿病大鼠的体重变化检测各组大鼠的血糖值和体重,结果如表1所示。与对照组相比,发病20d以上的糖尿病大鼠的体重明显降低,差异有统计学意义。糖尿病大鼠由发病到处死一直处于高血糖状态,与空白对照组相比差异有统计学意义。2.2认知能力变化如表2所示,行为观察结果表明,糖尿病鼠在发病40d内,认知能力无明显下降;发病50d能够观察到有轻微的认知变化,但差异无统计学意义;发病60d以上开始表现出认知损伤,训练次数、训练天数、错误次数和反应时间与对照组比较差异均有统计学意义。2.3糖尿病发病后ca1区神经元形态的变化HE染色结果如图1所示。正常大鼠海马CA1区神经元细胞规则排列,细胞圆而边缘清晰,胞核、核仁、胞质清晰可见;糖尿病发病40d,未表现出明显的神经元细胞损伤;糖尿病发病50d以后,神经元开始出现疏松,形态发生改变,排列松散,表现为细胞核固缩、胞质减少等凋亡细胞特有表现,或者是已经坏死消失;当发病60d后,其CA1区神经元细胞发生大面积形态改变;发病70~100d的检测结果显示,细胞损伤越来越严重。2.4小鼠海马ca1区神经元细胞数量的变化如图2所示,对照组的海马CA1区每毫米存活神经元细胞为(298±21)个;糖尿病发病50d海马CA1区存活的神经元细胞数量明显减少,差异有统计学意义;发病60d以上时,凋亡或坏死的神经元细胞数量进一步增多,并且随着发病时间的延长,细胞损伤越来越严重。3长期血糖状态下大鼠认知能力的变化本实验中经STZ诱导的大鼠,表现为多饮、多食、体重逐渐减轻、排尿量增多,符合典型的糖尿病发病特征,因此本实验糖尿病模型造模成功。很多研究报道已经阐述了糖尿病并发症中出现的细胞凋亡与长期的高血糖和氧化损伤有关,长期的高血糖能够引起实验动物的认知能力下降。已有很多学者利用不同的检测方法(包括Y迷宫、水迷宫等)对不同的糖尿病模型进行实验研究。Y迷宫作为一种辨别动物学习能力、工作记忆及参考记忆的检测手段,具有简便、可行等优点,并且具有一定的实用性。Y迷宫利用了啮齿类动物对新异环境天然探究的自然习性,不需要动物学习任何规则来趋利避害,能够有效地反映动物对新异环境的识别记忆能力。因此,本实验采用此方法检测大鼠学习认知能力。结果表明,STZ诱导的糖尿病大鼠长期处于高血糖状态(血糖值>23mmol/L),随着发病时间的延长,Y迷宫的检测结果显示其认知能力下降、反应时间延长。有研究表明STZ诱导糖尿病大鼠在发病13周(91d左右)可出现晶状体浑浊的白内障表现,发病24周可出现严重晶状体浑浊。但是,本实验中仅少数几只大鼠出现眼病,实验中已被排除。而且,Y迷宫实验在暗室中进行,每个臂端装有25度小灯泡,因此每臂的光强度足够,即使大鼠出现轻微白内障也能感受光的存在,因此可以排除该因素对Y迷宫实验结果的干扰。细胞凋亡导致的退行性神经紊乱,可严重影响中枢神经系统功能,已在不同的实验模型中被很多学者所阐述。大量的研究表明,海马组织作为大脑的重要组成部分,与学习、记忆功能密切相关,有学者认为海马可能就是大脑的主存储器,尤其是海马的CA1区神经元与学习记忆功能的关系更为密切。长期的糖尿病引起海马组织神经元损伤,继而引起细胞凋亡,最终导致学习、记忆功能下降。因此,本实验把检测实验大鼠海马CA1区神经元细胞凋亡或丢失作为重要的指标。研究结果表明,长期高血糖状态的大鼠,海马CA1区神经元发生细胞凋亡或丢失,并且随着发