石榴花多酚对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及糖代谢的影响

石榴花多酚对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及糖代谢的影响

新疆和田区独特的植物石榴花是治疗糖尿病的传统维医疗材料，在印度传统的尤纳尼医学中也有记载。石榴花富含没食子酸、熊果酸、齐墩果酸等酚类物质。研究发现熊果酸、齐墩果酸可调节胰岛素的敏感性、减轻胰岛素抵抗、以及抗氧化等多重功效。本课题组前期研究发现石榴花多酚可有效降低T2DM大鼠FPG和FIns,本次实验旨在通过研究石榴花多酚对糖尿病大鼠糖代谢中关键酶活性和肌、肝糖原含量的影响,初步探讨石榴花多酚降糖机制。1花、树、花多酚的提取美国产MicroplateReader血糖仪(罗氏公司活力型罗康全精密血糖仪);紫外可见分光光度仪(UV-2550,岛津Shimadzu);全自动生化检测仪(7170A,日立公司);酶标仪(Bio-radModel550,美国);石榴花购自新疆和田地区策勒县,经中科院新疆生态与地理研究所植物分类研究室沈观冕研究员鉴定为石榴科植物石榴P.granatum的花;中科院新疆理化技术研究所采用醇提工艺提取石榴花多酚;胰岛素酶联免疫定量检测试剂盒(上海沪峰生物科技有限公司,批号0903202);链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma公司,批号S-0130);白介素-6ELISA检测试剂盒(上海沪峰生物科技有限公司,批号09-05);肌、肝糖原试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20100115)和己糖激酶活性、苹果酸脱氢酶活性测试试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20100122);健康Wistar♂大鼠50只,体质量180～220g[新疆医科大学实验动物中心,许可证号:SCXK(新)2003-0001]。2方法2.1糖尿病成模大鼠的筛选♂大鼠,体质量(200±20)g,50只,室温18～22℃,湿度50%～60%,明暗周期12/12h,自由摄食、饮水。给予基础大鼠饲料(含碳水化合物53%,脂肪5%,蛋白质23%),大鼠适应性饲养1周,自由摄食、饮水。随机抽取8只大鼠作为正常对照组,给予普通标准饲料,其余大鼠均给予高脂饲料(基础饲料中加入食盐0.5%,白糖10%,猪油10%,蛋黄粉10%,胆固醇1%,猪胆盐0.5%,香油0.5%)喂养4周后,禁食8～10h,8只大鼠一次性腹腔注射等量0.1mol·L-1,pH4.4枸橼酸缓冲液,作为正常对照组;其余大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)45mg·kg-1(STZ溶于0.1mol·L-1pH4.4枸橼酸缓冲液中)。72h后,禁食8～10h后大鼠尾静脉取血测FPG,33.3mmol·L-1>FPG值≥11.1mmol·L-1范围内,确定为糖尿病成模大鼠。2周后再测血糖,血糖值居高不下仍维持在以上范围内者,证明模型稳定,予以选用进入正式实验。2.2认识榴花多酚对高脂饲料的治疗将造模成功的30只大鼠随机分为3组:模型组(给予纯化水)、石榴花多酚低剂量组Ⅰ(PFPⅠ组给予石榴花多酚100mg·kg-1体质量灌胃)、石榴花多酚高剂量组Ⅱ(PFPⅡ组给予石榴花多酚300mg·kg-1体质量灌胃),并持续给予高脂饲料,正常对照组给予纯化水及基础饲料。治疗周期均为4周。灌胃给药期间有死亡(系灌胃操作不当所致,模型组死亡一只,给药组各死亡2只),最终按每组8只做统计。2.3elisa法检测实验结束后大鼠禁食12h,先从尾静脉取血测定FPG。再将大鼠麻醉后从腹主动脉取血,离心取血清,ELISA法测定血清胰岛素和白介素-6;按试剂盒说明测定游离脂肪酸浓度、肝糖原和肌糖原含量及己糖激酶和苹果酸脱氢酶活性;按文献方法计算:胰岛素抵抗指数(Homa-IRI)=FPG×空腹胰岛素/22.5。2.4统计处理采用SPSS16.0进行统计学处理,单因素方差分析。3结果3.1fpg及fins的表达成模后糖尿病大鼠FPG和Fins均较正常对照组显著升高(P<0.01),经PFP干预4周后,T2DM大鼠FPG和Fins有所降低,与模型组相比差异有显著性(P<0.05),见表1。3.2周各组fa、ffa和iri的比较与正常对照组相比,模型组大鼠的IL-6、FFA和IRI显著升高(P<0.05～0.01),给予PFP4周,IL-6、FFA和IRI均显著降低,(P<0.01),见表2。3.3pfp4周对小鼠骨骼肌mdh和hg活性的影响与正常对照组大鼠比较,模型组大鼠骨骼肌中HK活性、MG和HG含量明显下降(P<0.05～0.01),肝脏MDH活性显著升高(P<0.05)。灌胃PFP4周后,两剂量组骨骼肌中HK活性和MG含量有不同程度增加,HK仅高剂量组差异有极显著性(P<0.01)。HG变化不明显,差异无显著性。干预后MDH活性降低(P<0.05)。见表3。4pfp对大鼠血糖、血脂和胰岛素水平的影响2型糖尿病病程发展过程中,不仅胰岛素利用出现障碍(即胰岛素抵抗),糖代谢过程中各关键酶的活性也发生变化,最终导致葡萄糖无法有效转入细胞,血糖升高。己糖激酶是糖代谢的第一个关键酶,也是葡萄糖以糖原形式贮存通路中的第一个限速酶。研究表明,正常或低糖浓度下,葡萄糖转运是细胞对葡萄糖摄取的限速步骤,但高糖条件下,HK对葡萄糖的磷酸化则成为限速步骤。本研究结果显示,HK活性:PFPⅡ组>正常对照组>PFPⅠ组>模型组;PFPⅡ组与模型组相比,差异有显著性。PFPⅠ组的HK活性有所增加,但与模型组相比差异无显著性。肌糖原含量:正常对照组>PFPⅡ组>PFPⅠ组>模型组。提示PFP通过增强糖尿病大鼠骨骼肌中HK活性促进肌糖原的合成贮存,减少血液中游离的葡萄糖,这可能是促使T2DM大鼠血糖降低的机制之一。本实验中肝糖原含量未发生显著改变。可能与PFP增强不同组织对胰岛素的敏感性不同有关,还需进一步研究。苹果酸脱氢酶(MDH)是三羧酸循环的关键酶,位于线粒体的基质内,参与细胞膜氧化磷酸化及脂肪酸的合成,既往有国内的研究报道实验性糖尿病动物MDH的活性显著降低。不同的是,在本试验中MDH的活性在模型组升高,干预后降低。这可能与早期细胞内氧化能力增强有关,MDH活性增强,有氧氧化代谢增强,促进脂肪酸合成增加。这与结果中脂肪酸增加相符。胰岛素抵抗贯穿2型糖尿病的病程发展,决定病情发展的方向。游离脂肪酸和炎症因子IL-6在胰岛素抵抗的发生过程中扮演着重要的角色。FFA升高,抑制己糖激酶活性。FFA还可抑制肌糖原合成。正常成人肌糖原总量平均为350～400g,肝糖原总计为75～90g。餐后胰岛素介导的葡萄糖摄取约85%由骨骼肌组织来完成。FFA增加可使糖原合成酶亚单位分离,失去其生物活性,这是糖原合成的限速步骤。从而导致糖原合成降低。炎症因子IL-6受血糖调节,高血糖可致IL-6分泌增加,IL-6增高会引起FFA增高。加重胰岛素抵抗。本实验结果显示PFP显著降低血糖、血清胰