象耳豆根结线虫环介导等温扩增快速检测方法的建立

象耳豆根结线虫环介导等温扩增快速检测方法的建立

0象耳豆根结线虫的检测根结线虫是一种特殊的植物根系内生物。在世界上，由这种疾病引起的疾病到处都是这种疾病，每年都会给农业生产带来巨大的经济损失。截止目前,全世界共记录了106种根结线虫,其数量还在不断增加。象耳豆根结线虫(M.enterolobii)最先在中国海南省象耳豆树(Enterolobiumsp.)上发现,Xu等认为玛雅古根结线虫(M.mayaguensis)和象耳豆根结线虫是同一个种。目前象耳豆根结线虫在亚洲、非洲、欧洲、美洲等地均有分布,其中中国南方地区分布广泛,且危害较为严重。象耳豆根结线虫能够寄生包括豆科(Fabaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、茄科(Solanaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、番荔枝科(Annonaceae)和竹芋科(Marantaceae)等多种植物,并可克服Mi抗原基因的抗性,同时不会被最具控制植物根结线虫生防前景的穿刺巴氏杆菌(Pasteuriapenetrans)寄生。由于象耳豆根结线虫特殊的生物学特性,一旦大面积扩散或定殖,将会造成毁灭性的灾难,现已经成为中国热带、亚热带地区作物的一个重要潜在病原物。目前,欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)将其列入警报名录,美国和韩国将其列为植物检疫对象。由于象耳豆根结线虫的形态检测难度大,传统分子检测需要专业的仪器才能够进行,因此,亟需建立一种快速、便捷的直接从罹病植物组织中检测象耳豆根结线虫的LAMP检测技术,从而为该病害的田间检测和监测提供有力的技术支持。【前人研究进展】象耳豆根结线虫的会阴花纹与南方根结线虫(M.incognita)非常相似,常规方法很难对其进行准确的判定。Blok等发现象耳豆根结线虫的IGS序列和其它4种根结线虫具有明显差异;Blok等根据根结线虫mtDNA差异,开发出象耳豆根结线虫PCR检测方法;Xu等通过对多种根结线虫的mtDNA进行PCR-RFLP分析,开发出象耳豆根结线虫的快速检测技术;Long等根据象耳豆根结线虫与其它根结线虫IGS的差异,设计出象耳豆根结线虫特异性PCR检测引物;Adam等根据南方根结线虫、爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)、玛雅古根结线虫、北方根结线虫(M.hapla)、奇诺伍德根结线虫(M.chitwoodi)和伪哥伦比亚根结线虫(M.fallax)7种根结线虫的RAPD标记设计出检测玛雅古根结线虫的特异性引物;Tigano等开发出SCAR标记引物特异性的检测象耳豆根结线虫的技术;Hu等开发出从植物根结中检测象耳豆根结线虫的多重PCR检测技术。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是Notomi等发明的一种新式恒温核酸扩增技术,在60—65℃恒温条件下使用该技术,1h内即可完成对靶标物的扩增和检测。目前LAMP技术在植物线虫快速检测中已得到广泛应用。Kikuchi等开发出松材线虫(Bursaphelenchuhxylophilus)LAMP快速检测体系,能在1h内从病木中检测出松材线虫;Niu等开发出南方根结线虫的LAMP检测体系,能够从根结中直接检测南方根结线虫;Niu等根据象耳豆根结线虫IGS的差异建立了LAMP检测体系;Peng等建立了从罹病植物组织中检测香蕉穿孔线虫(Radopholussimilis)的LAMP检测体系。【本研究切入点】目前针对象耳豆根结线虫的快速分子检测体系已有多次报道,但其检测的靶基因主要为IGS和mtDNA,以象耳豆根结线虫ITS为靶标的快速分子检测尚未见报道。【拟解决的关键问题】探索以象耳豆根结线虫核糖体DNA-ITS区为新靶标,建立一种能够从罹病植物组织中检测象耳豆根结线虫的LAMP检测方法,以期丰富象耳豆根结线虫分子检测手段,为该病害的田间检测和监测提供有力的技术支持。1材料和方法试验于2010年5月至2011年12月在中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室完成。1.1试验线沿线本研究所用植物线虫种群从全国各地采集,并由本实验室分离纯化,在中国农业科学院植物保护研究所温室扩繁保存(表1)。1.2细胞培养和生化药物rTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNAMarker购自宝生物工程(大连)有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒和DH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司;pGEM-Teasy克隆载体购于美国Promega公司;蛋白酶K购自德国Roche公司;SYBRGreenⅠ购自美国Invitrogen公司;甜菜碱购自美国Sigma公司;BstDNA聚合酶大片段购自美国NEB公司;LFD试纸购自德国MileniaBiotec公司。1.3方法1.3.1lamp的制备DNA提取方法参考万新龙等的方法略有改动。在显微镜下挑取单头供试线虫放入装有10uf06dLddH2O的0.2mL离心管中,加入8uf06dL的10×PCRbuffer溶液(TaKaRa),2uf06dL蛋白酶K溶液,采用冻融法反复冻融6—7次,-80℃下保存30min,65℃温育90min,95℃反应10min,反应完成后,12000r/min离心1min,上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。1.3.2pcr扩增条件采用rDNA-ITS区的通用引物,以基因组DNA为模板,PCR扩增根结线虫种群ITS区。PCR反应体系:10×Buffer(含Mg2+)5µL,10mmol·L-1dNTP4µL,引物rDNA1和rDNA2(10μmol·L-1)各1µL,rTaq酶(5U·µL-1,TaKaRa)2.5U,模板DNA5µL,ddH2O补足至50µL。扩增条件:95℃5min;95℃30s,54℃30s,72℃1min,35个循环;72℃10min;4℃保存。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,EB染色,回收、连接、转化按照试剂盒说明书进行,阳性克隆经菌液PCR验证后送北京六合华大科技有限公司测序。1.3.3根结线虫rna根据象耳豆根结线虫rDNA-ITS测序结果,同时从NCBI下载10种其它根结线虫ITS序列,采用MEGA4.0比对分析根结线虫rDNA-ITS差异性。根据分析结果,采用PrimerExplorerV4软件(http://primerexplorer.jp)设计LAMP引物(表2)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.3.43.13.5和810.LAMP反应条件参照Notomi等所述,对反应中起关键作用的Mg2+、dNTPs、甜菜碱的浓度和反应时间等条件进行优化。反应体系包括外引物MEF3和MEB3各0.2μmol·L-1,内引物MEFIP和MEBIP各1.6μmol·L-1,环引物MELB为0.4μmol·L-1,dNTPs(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mmol·L-1),20mmol·L-1Tris-HCl(pH8.8),10mmol·L-1KCl,MgSO4(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mmol·L-1),10mmol·L-1(NH4)2SO4,0.1%Tritonx-100,甜菜碱(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mol·L-1),8UBstDNA聚合酶大片段,1µLDNA模板,用灭菌双蒸馏水补全到25µL。混合均匀后,置于60—65℃恒温水浴中保温30—90min,82℃保温5min。1.3.5探针引物的设计LAMP扩增产物检测采用3种方法。SYBRGreenⅠ显色法:LAMP反应结束后,加入2µL100×SYBRGreenⅠ,混匀后肉眼直接观察颜色变化;琼脂糖凝胶电泳法:取2µL扩增产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳,EB染色,结果在凝胶成像系统中观察;LFD试纸法:采用Primer5.0软件在F3和B3序列之间设计探针引物,5′端用FITC标记,MEFIP引物的5′端用生物素标记。LAMP反应结束后,加入5µLFITC标记的探针(20pmol·L-1),63℃保温5min,冷却到室温。取8µL的杂交液加入100µLPBS缓冲液中,混合均匀后将LFD试纸浸入到杂交后的溶液中,5min后观察照相。1.3.6lamp的检测分别提取象耳豆根结线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、香蕉穿孔线虫、短体线虫(Pratylenchuscoffeae)、甘薯茎线虫(Ditylenchusdestructor)、大豆孢囊线虫(Heteroderaglycines)、禾谷孢囊线虫(H.avenae)和松材线虫的基因组DNA(表1)作为模板进行LAMP检测,同时使用Long等的特异性引物(表2)进行普通PCR扩增,作为对照,反应体系和反应条件参照1.3.2所述。1.3.7lamp反应和检测将单头象耳豆根结线虫雌虫DNA按10倍梯度稀释成7个浓度(1—1.0×10-6)作为模板,按照1.3.4优化的体系进行LAMP反应和检测。同时以上述稀释DNA为模板,以MEF3和MEB3为引物,进行常规PCR检测作为对照,反应体系和条件参照1.3.2所述。1.3.8常规pcr检测从人工接种象耳豆根结线虫和南方根结线虫的番茄根系分别取10个根结,同时从温室培养的5种常见根结线虫(表1)的番茄根部随机取15个根结,同时取健康番茄根作为阴性对照,将上述罹病根系的根结和健康番茄根分别放入装有17.5μL的10×PCRbuffer的离心管中,加入7.5μL的蛋白酶K(600μg·mL-1)和25μL无菌水,混合均匀后离心,放入液氮中速冻,用研磨棒充分捣碎,点动离心后,将离心管放入65℃条件下温育90min,95℃下反应10min,冷却至室温,12000r/min离心1min后的上清液即可作为DNA模板进行LAMP试验和常规PCR检测,以健康植物根的DNA作为对照。2结果2.1象耳豆根结线虫his采用通用引物扩增获得象耳豆根结线虫(MEDT和MEXED)ITS序列长度为770bp,NCBI序列注册号分别为JX024149和JX024150。Blast比对结果发现,本研究的象耳豆根结线虫与已报道的象耳豆根结线虫ITS序列(GenBank:JF309153和JQ082448)相似性为99%,与其它的根结线虫ITS区的相似性为85%—90%。根据象耳豆根结线虫ITS非保守序列和LAMP引物设计结果,获得5条LAMP引物,包括2条外引物(MEF3和MEB3)、2条内引物(MEFIP和MEBIP)和1条环引物(MELB)。同时采用Primer5.0软件在MEF3和MEB3之间设1条杂交探针Probe,5′端加上FITC标记,MEFIP5′端采用生物素标记,用于扩增产物的LFD检测,具体见图1和表2所示。2.2me-lamp反应体系反应时间的确定Mg2+浓度优化结果表明,当Mg2+的浓度在2.0—8.0mmol·L-1时,LAMP扩增效率呈现先增高后降低(图2-A)。反应体系中Mg2+浓度为2.0、3.0mmol·L-1时,没有检测到扩增产物,Mg2+浓度为4.0mmol·L-1时,可以检测到少量扩增产物,Mg2+浓度为5.0mmol·L-1时,LAMP扩增效率最高;Mg2+浓度增加到6.0、7.0和8.0mmol·L-1时,扩增效率随之降低,由此确定ME-LAMP反应体系中Mg2+浓度的最佳浓度为5.0mmol·L-1。在dNTPs浓度为0—2.4mmol·L-1的条件下,LAMP扩增效率呈现逐渐提高(图2-B)。在dNTPs浓度为0—1.6mmol·L-1时没有扩增条带,当dNTPs浓度为2.0mmol·L-1时,可以观察到微弱条带,在dNTPs浓度为2.4mmol·L-1时可以看到清晰、较亮的特异性条带,由此确定,本反应体系的dNTPs的最佳浓度为2.4mmol·L-1。在甜菜碱浓度为0—0.6mmol·L-1的条件下(图2-C),随着甜菜碱浓度的增加,LAMP扩增产物随之减少,在甜菜碱浓度为0的条件下扩增效率最强,因此本体系中不需要添加甜菜碱。反应时间为15min时,没有LAMP扩增产物,反应30min后可以检测到大量的扩增产物,但随着时间的进一步延长,扩增产物没有明显差异(图2-D)。为了保证试验结果的稳定,本试验选取的反应时间为45min。综上所述,象耳豆根结线虫LAMP检测方法,经优化后的反应体系:Mg2+的浓度为5.0mmol·L-1、dNTPs的浓度为2.4mmol·L-1、不添加甜菜碱、反应时间为45min。2.3lamp反应产物的分离纯化采用优化的LAMP扩增体系,检测2个象耳豆根结线虫种群。2个象耳豆根结线虫种群的LAMP扩增产物采用3种方法均能够成功检测:向LAMP反应产物中加入SYBRGreenⅠ染料,肉眼观察发现,阳性结果呈现绿色,阴性对照则呈现橘红色(图3-A);LAMP反应产物在2%琼脂糖凝胶上分离,阳性结果可见LAMP扩增的特异性的梯形条带,阴性结果则无条带(图3-B);LFD试纸的检测结果显示,阳性结果可以看到试纸条上同时出现2个检测条带,而阴性结果只有1个带(图3-C)。2.4象耳豆根结线虫pcr检测以5种根结线虫和6种其它植物线虫DNA为模板,进行LAMP和PCR扩增,测试ME-LAMP检测体系的特异性。结果表明,只有在以象耳豆根结线虫DNA为模板的LAMP反应中才能检测到扩增产物,其它植物线虫均未检测到扩增产物(图4-A)。同时采用象耳豆根结线虫特异性引物进行PCR反应验证(图4-B),PCR扩增也只在象耳豆根结线虫中有大小约为300bp的条带,其它样品均无扩增结果。LAMP扩增结果与PCR特异性扩增结果完全一致,由此确定本研究建立的象耳豆根结线虫LAMP检测法具有很高的特异性。2.5lamp扩增产物的检测将象耳豆根结线虫单头雌虫DNA按照10倍梯度进行稀释作为模板进行LAMP和PCR扩增,检测和比较LAMP检测方法的灵敏度。结果表明,单头线虫DNA在稀释到10-4后,仍能够检测到扩增产物,继续将DNA浓度稀释到10-5后,没有检测到LAMP扩增产物(图5-A);普通PCR扩增结果显示,当模板DNA稀释到10-2倍时,可看到微弱的条带,继续稀释时则不能检测(图5-B)。由此可见象耳豆根结线虫LAMP检测的最低模板阈值为1/200000头根结线虫雌虫DNA,PCR检测的最高灵敏度为1/2000头根结线虫雌虫DNA,由此可见,LAMP检测方法比常规PCR的灵敏度至少高100倍,具有极高的检测灵敏度。2.6南方根结线虫阳性的pcr检测对人工接种番茄培养的象耳豆根结线虫和南方根结线虫的根结进行LAMP和PCR检测结果表明,从人工接种象耳豆根结线虫的番茄根部获得的10个根结,采用LAMP法检测,用SYBRGreenⅠ、电泳检测、LFD试纸3种方法进行观测,均显示阳性结果,接种南方根结线虫植株的根结和健康的植株均显示阴性。而用PCR扩增方法,从10个象耳豆根结线虫的根结中仅成功检测出7个为阳性,南方根结植株的根结和健康的植株均显示阴性(表3)。随机检测15个根结的结果表明,在象耳豆根结线虫LAMP检测为阳性的3个根结中,PCR检测也获得阳性结果(图6)。由此确定本研究建立的象LAMP检测体系能够直接中根结中直接检测象耳豆根结线虫,具有很高的实际应用价值。3讨论3.1象耳豆根结线虫检测象耳豆根结线虫分布广泛,在中国南方地区发生较广,且危害严重,由于其能抵御Mi基因的抗性,因此严重制约着抗性品种在中国南方地区的推广和应用。如何简便、快捷、有效地检测象耳豆根结线虫,是亟待解决的技术难题。本研究以rDNA-ITS序列作为靶基因,通过一系列完整实验,建立了简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点的、直接从植物根结中检测象耳豆根结线虫LAMP检测方法,能够在1h内直接从植物根结中检测该线虫。该检测方法的建立对象耳豆根结线虫的发生分布和监测具有重要的意义,在农业生产一线和口岸检测中具有很大的应用前景。由于象耳豆根结线虫ITS,IGS及mtRNA与其它根结线虫差异较大,象耳豆根结线虫ITS序列比对结果表明,它与其它根结线虫的相似性为85%—90%(图1),Brito等认为,核糖体DNA-ITS序列是象耳豆根结线虫分子检测的潜在靶标。目前已开发的象耳豆根结线虫快速分子检测体系中,主要以IGS、mtDNA和RAPD特异性片段等为检测靶基因。本研究开发的象耳豆根结线虫LAMP检测方法是以rDNA-ITS序列作为靶基因,从rDNA-ITS的7个位点上设计出5条引物,相对于常规PCR的2条引物而言,极大的提高了特异性。以象耳豆根结线虫ITS为靶基因开发出快速分子检测技术尚未见报道。3.2象耳豆根结线虫lamp的检测方法本研究建立的直接从植物根结中检测象耳豆根结线虫LAMP检测方法,具有以下特点:(1)快速、便捷、准确。只需要45min即可完成反应,比常规PCR检测节省2h以上,而且对仪器设备要求低,不需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统等昂贵仪器,使用水浴锅即可完成检测。反应结果可以加入荧光染料,通过肉眼观察即可判定结果。同时,运用LFD试纸对LAMP检测结果进行验证,通过特异性探针和LAMP扩增产物杂交后,插入横向流动试纸,通过试纸的指示带即可判定结果,该方法可以有效的避免由于非特异性扩增或引物二聚体而出现的假阳性结果,极大的提高了检测的准确度。(2)灵敏度高。相比常规PCR检测方法,象耳豆根结线虫LAMP检测具有更高的灵敏度。象耳豆根结线虫LAMP法检测极限可低至1/200000头线虫DNA,采用MEF3/MEB3为引物的PCR检测灵敏度为1/2000头线虫,相比而言LAMP法的灵敏度比常规PCR高100倍。比Tigano等采用SCAR标记引物检测象耳豆根结线虫的检测灵敏度为单头线虫DNA,灵敏度则更高。Niu等报道的以IGS为靶基因的象耳豆根结线虫LAMP法的灵敏度为1/2000头线虫DNA。与其它植物线虫LAMP检测方法相比,松材线虫LAMP检测的灵敏度为1/25000头线虫DNA,香蕉穿孔线虫LAMP检测方法的灵敏度为1/20000头线虫DNA。可见,本研究建立的象耳豆根结线虫LAMP检测方法的灵敏度极高,能够检测到痕量的象耳豆根结线虫DNA。(3)特异性强。在特异性检测结果中,本研究建立的LAMP检测方法能够特异的扩增象耳豆根结线虫,其它4种常见根结线虫和6种植物线虫均未检测到阳性结果,具有较高的的