温州医科大学附属第一医院神经老化与疾病研究重点实验室

PAGEPAGE3温州医科大学附属第一医院神经老化与疾病研究重点实验室细胞生物学实验工作程序温州医科大学附属第一医院神经老化与疾病研究重点实验室温州医科大学附属第一医院神经老化与疾病研究重点实验室细胞生物学实验工作程序编制：审核：批准：发布日期：实施日期：目录文件编号名称页码修订页4-5LAB-ZX-XB-1细胞培养室的设置、设备及管理6-9LAB-ZX-XB-2实验室内务管理及清洁10-11LAB-ZX-XB-3实验室人员行为规范12LAB-ZX-XB-4生物防护13-14LAB-ZX-XB-5实验室废弃物处理程序15LAB-ZX-XB-6净化工作台的操作使用程序16LAB-ZX-XB-7生物安全柜操作使用程序17LAB-ZX-XB-8CO2培养箱的操作使用程序18LAB-ZX-XB-9倒置显微镜的操作使用程序19LAB-ZX-XB-10离心机操作使用程序20-21LAB-ZX-XB-11恒温水浴箱操作使用程序22-23LAB-ZX-XB-12加样器操作使用及校准程序24-27LAB-ZX-XB-13Millipore水纯化系统操作程序28LAB-ZX-XB-14组织块培养法操作程序29-31LAB-ZX-XB-15消化培养法操作程序32-34LAB-ZX-XB-16细胞传代操作程序35-37LAB-ZX-XB-17细胞冻存和复苏操作程序38-40LAB-ZX-XB-18细胞生长曲线操作程序41-42目录文件编号名称页码LAB-ZX-XB-19四唑盐试验比色试验操作程序43-44LAB-ZX-XB-20实验耗材的购买、质检和储存程序45-46LAB-ZX-XB-21实验室的清洁程序47-47修订页页码条目原内容修订内容修订者批准者修订日期修订页页码条目原内容修订内容修订者批准者修订日期一、细胞培养室的设置、设备及管理1.目的：细胞培养实验室应有专人负责，依照实验室管理规范实施全面质量管理，保证实验质量。2.范围：本制度适用于所有开展细胞培养实验的实验室人员及相关人员，并明确了实验室各项规章。负责人：张红霞3.规章3.1.细胞培养室的分区设置：细胞培养实验室设置为无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。无菌操作区与清洗、消毒灭菌区应分别位于两端，而制备、储藏和孵育区位于两区之间。其中无菌操作区最好能单独设置。各区共用一个缓冲区(即内走廊)，主要用于更换工作服、鞋套，实验室布局见图示一。3.1.1.无菌操作区：无菌操作区是只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。无菌操作间为密闭式，一般无菌操作区的空气消毒用紫外线灯。3.1.2.孵育区：本区对无菌的要求虽不必如无菌区那样严格，但仍需清洁而无灰尘。一般实验室多采用孵箱进行。3.1.3.制备区：该区主要进行培养液及有关培养用液体等的制备。在有天平、PH计、磁力搅拌器等设备下完成制备以后，应在无菌操作台进行过滤除菌。3.1.4.储藏区：对储藏区的要求是取放方便，主要有冰箱、干燥箱、液氮罐、培养瓶等，此环境也需要清洁、无尘。3.1.5.清洗和消毒灭菌区：清洗和消毒灭菌区应与其他区分开，主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等的工作。3.2.细胞培养室的设备3.2.1.净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好，为培养工作提供了良好的无菌操作环境。3.2.2.显微镜；倒置显微镜是细胞培养室所必需，是供日常工作常规使用，为了掌握细胞的生长情况并观察有无污染灯。配置照相系统，以便摄像、记录细胞的情况，有助于开展科研工作。3.2.3.培养箱：体外培养的细胞和体内细胞一样，都需要在恒定的温度下才能生存，大多数情况下，最适温度是37℃，温差变化一般不应超过±0.5℃，因此需要有能控制温度的培养箱。CO2培养箱能恒定的提供所需要的一定量的CO2（常用5％CO2），使培养液的PH值保持稳定。3.2.4.离心机：进行细胞培养时，常需要制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等，因此需使用离心机。一般若需细胞沉降，使用80-100g离心力即可。3.2.4.冰箱：冷藏室用于储存培养液、生理盐水、Hanks液试剂等培养用的物品及短期保存组织标本，-20℃则用于储存需要冷冻保持生物活性及较长时期存放的制剂，如酶、血清等。细胞培养室的冰箱应属专用，不得存放挥发、易燃等对细胞有害的物质，且应保持清洁。3.2.5.水浴箱：用于培养液，Hanks液，消化酶等培养用液的温热，牛血清的灭活等3.2.6.水纯化装置：细胞培养对水质量要求很高，水纯化装置能提供高质量的水，用于配制各种培养液及试剂。3.2.7.细胞培养常用器皿：包括细胞培养瓶，培养皿，多孔培养板，吸管，加样器等。3.3.细胞培养室的工作制度：本室为10000级净化层流室改建房间，为保证操作无菌净化的可靠性和安全性，出入人员必须做到：3.3.1.尽量减少出入次数。外来人员必须经本室负责人同意后方可进入。3.3.2.凡进入层流室的工作人员，必须在缓冲间内更换拖鞋，工作服，佩带帽子、口罩。患有严重感染者不得进入。3.3.3.实验用品必须喷洒酒精，经紫外消毒灭菌后方可传入。3.3.4.操作前操作台及层流台台面用75％酒精或3％新洁尔灭溶液镲拭。3.3.5.操作者戴无菌手套，严格执行无菌操作，操作时尽量减少室内走动，保持室内安静。3.3.6实验做完后，以75％酒精或3％新洁尔灭溶液镲拭操作台面，移除废弃物品，整理好室内物品，及时清洗消毒，打开层流台及工作间紫外灯，至少照射30分钟以上，记录紫外灯使用情况。3.3.7.室内空气及二氧化碳培养箱应定期消毒。3.3.8.走出层流室，在缓冲区脱掉工作服，将手套及鞋套置于专用污物桶中。3.3.9.每次实验记录，书写工整详细。3.3.10.每周检查有无过期或将近到期的试剂，或作报废处理或优先使用，避免浪费，然后记录试剂的详细保存情况。3.3.11.实验中所使用的离心管、吸头等需经高压灭菌处理，使用时应在消毒有效期内。3.3.12.实验工作完成后，将使用过的离心管、吸头置于盛有1％施康消毒液或类似消毒液的废液缸中。二、实验室内务管理及清洁1.内务管理及清洁制度1.1.内务管理制度1.1.1.实验人员要有强烈的时间观念，按时上下班，不迟到、早退。1.1.2.非本室工作人员未经允许不得进入实验室。1.2.3.实验人员必须熟悉仪器性能方可操作，严格遵守操作规程。1.2.4.所有仪器须有专人负责，有使用维护记录。1.2.5.注意保持仪器卫生整洁，严禁在实验室内抽烟，吃零食。1.2.6.每天了解仪器运转情况及试剂使用情况，负责仪器的整洁，安全，检查电源，水龙头，节假日应指定人员负责检查实验室的仪器、设备，确保安全。1.2.内务清洁制度1.2.1.实验室人员：1.2.1.1.实验室地面必须平整、干净，通道要利于通行，没有无用的物品阻碍。1.2.1.2.合理规划实验室内物品，做到摆放整齐、有序，无用的或使用效率低的物品放置到储存处，常用的物品要容易寻找到。1.2.1.3.抽屉、柜子、文件类物品要作好标记，以方便识别。1.2.1.4.实验结束后用75%酒精对台面进行清洁，并经紫外灯进行消毒。1.2.1.5.实验过程中如发生试剂外溅，应立即用75%酒精擦洗。1.2.1.6.每天实验前开启各区的通风系统，各区实验结束后打开该区移动紫外灯消毒实验台面，紫外灯每天开启60分钟。1.2.1.7.每天下班前要关门、关窗、检查空调和仪器的电源是否关闭。1.2.2.卫生员：1.2.2.1.每天实验结束，待紫外灯消毒时间足够后，依次关闭各区紫外灯并记录。1.2.2.2.依次清洁三个区的地面，各区清洁消毒工具均专用，不可混用，注意按照单一方向流程的原则来进行清洁。1.2.2.3.处理好各区废弃物，交医院集中处理。三、实验室人员行为规范一、目的:依照实验室管理规范来约束实验室人员日常行为,保证细胞培养实验的顺利完成。二、范围:适用于所有操作细胞培养实验的实验人员。三、职责:在科主任的监督，由实验室负责人领导下负责实施。四、规范:1.每天按时上下班，做到不迟到，不早退。2.上班时间内不得擅自离开工作岗位,特殊情况需请假。3.每次实验前要打开紫外灯照射。4.实验人员应保持仪表整洁,工作区域须穿工作服,离开时应换下。5.工作区域内尽量少走动,并动作幅度尽量小。6.严格遵守实验操作规范,不得随意更改操作步骤。7.操作过程应严谨、认真,不得同时做与实验无关的事情,如确有需要,应暂停工作,并记录下已进行的步骤。8.每日实验结束后，做好清洁工作和各项记录。9.实验室内不得饮食,不得吸烟，不得做与实验无关的事。10.对仪器要正确使用和维护,节约消耗品,减少浪费。11.下班前要检查门窗、空调及仪器的电源是否关闭,处理好废弃物。四、生物防护1.目的：预防实验室工作人员在实验工作过程中被感染。在预防实验室污染的同时也防止病毒、细菌和其它病原体交叉感染。2.范围：细胞培养室工作人员。3.职责：3.1实验室组长有责任保证每一工作人员在上岗前熟悉本程序内容，并保证所需设备、物质齐全。3.2所有工作人员必须在工作中严格遵守本程序各项防护措施。4．感染途径：细胞培养工作人员在接触实验操作过程中，可能被感染，故工作人员应做好防护，防止病毒、细菌和其它病原体感染。5.预防措施：5.1细胞培养工作人员都应穿工作服，戴上手套、口罩、工作帽。5.2工作桌面或地面一但有污染时，应及时用75％酒精清洁桌面及地面。5.3在标本处理过程中，手或其它部位的皮肤在接触含感染源液体后必须立即用自来水充分清洗。5.4实验完毕离开时，应脱下所有该实验区个人防护设备。5.5废弃物消毒处理：先用10%的次氯酸钠消毒，然后进行焚烧处理。五、实验室废弃物处理程序1.无菌物品，如棉签、棉球、纱布等应在有效期内使用，使用后的废物品应及时进行无害化处理，不得随意丢弃。2.使用合格的一次性实验用品(如试管、吸头、离心管等)，用后放入污物袋内交医院集中处理。3.污染的吸管等投入盛有1%施康消毒液的容器内浸泡一昼夜后经高压蒸汽灭菌再进行洗涤。4.对各种有毒化学试剂应用后，要做相应的无害化处理，防止污染环境。5.实验室所有垃圾，送医学院或医院垃圾处理站。6.污染的非一次性工作衣应先消毒后再洗涤。六、净化工作台的操作使用程序1.目的：保证净化工作台良好的无菌操作环境。2.适用范围：各种品牌、型号的净化工作台。3.操作步骤：3.1检查电源电压是否匹配后，接通电源。3.2净化工作台使用前必须用75%酒精棉球擦拭，紫外线灯消毒至少30分钟。3.3关闭紫外灯后应送风使之运转两分钟后再进行培养操作。3.4工作台使用后操作过程中出现液体不慎泄漏，立即用75%酒精擦拭。3.5使用完毕以后，及时清除工作台面上的物品，用75%酒精棉球擦拭台面使之始终保持洁净。3.6每周用沙布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面揩擦干净，保持表面清洁，以免影响紫外灯消毒效果。3.7高效过滤器三年更换一次，粗过滤器中的过滤布每3～6个月拆下清洗一次。七、生物安全柜操作使用程序1.目的：保证生物安全柜内的高洁净、无污染。2.适用范围：所有型号生物安全柜3.使用方法：3.1检查电源电压是否匹配后，接通电源。3.2生物安全柜使用前必须用10%次氯酸钠液擦拭工作台面、70%酒精棉球擦拭紫外线灯再开启紫外线消毒至少30分钟。3.3消毒及工作期间严禁打开风机，始终保持工作台内“死屏”即无空气对流效果。3.4工作台使用后操作过程中出现液体不慎泄漏，立即用软布蘸10%次氯酸钠反复清洗，然后再用70%酒精擦拭，然后紫外灯消毒30分钟后关机。3.5每周用沙布沾上酒精将紫外线杀菌灯表面揩擦干净，保持表面清洁，以免影响紫外灯消毒效果。八、CO2培养箱的操作使用程序1.目的： 保证CO2培养箱的无菌环境及适宜温度、湿度、PH。2.适用范围：各种品牌、型号的CO2培养箱。3.操作步骤：3.1检查电源电压是否匹配后，接通电源。3.2培养箱放置在净化室的孵育区，要求环境清洁而无灰尘。3.3细胞培养箱设置的最适温度是37℃，温差变化一般不应超过±0.5℃。3.4维持培养箱恒定的CO2浓度，一般是5%，使培养箱的PH值保持稳定，适用于开放或半开放培养。3.5培养箱底部放置盛无菌蒸馏水的水槽，保证培养箱内的相对湿度100%，防止培养液蒸发。3.6培养箱内空气必须保持清洁，定期以紫外灯或酒精檫拭消毒。3.7培养箱内的水槽要保证有水，并定期进行更换，谨防霉菌污染及细菌污染等。3.8培养箱的不锈钢内壁及搁板应定期进行消毒，可以75%酒精檫拭消毒。3.9有严重污染时搁板应进行高温干热消毒，此时需加热到160℃，保持2小时；培养箱内进行甲醛熏蒸（此时细胞不宜放置在里面）。九、倒置显微镜的操作使用程序1.目的：保证倒置显微镜的正常运行。2.适用范围：适用Leica,Olympus显微镜。3.操作步骤：3.1检查电源电压是否匹配后，并连接可靠地线。3.2倒置显微镜放置在净化室的孵育区，要求环境清洁而无灰尘。3.3倒置显微镜应放置在水平坚固的台面上，尽量减少震动。3.4显微镜的镜头应定期进行清洁，使用专用檫镜纸或真丝布进行檫拭，严禁用粗糙的纸张檫洗镜头。3.5把培养物放在载物台上，打开电源开关，调节光源的亮度，根据观察者的瞳距调节目镜间距离，调节粗调直至找到细胞界面。3.6观察细胞时选择合适的物镜倍数，并选择相应的相差环（10×物镜配合10相差环使用；20×物镜配合20相差环使用，以此类推），并调节左眼目镜，同时调节细调，以达到最佳的观察效果。3.7打开荧光光源，稳定30min后，先按上述两步找到细胞后，关掉可见光，方可进行荧光观察。十、离心机的操作使用程序1.目的：保证分离技术的可行性。2.适用范围：各种普通台式离心机。3.使用方法：3.1离心机应放置在水平坚固的平台或地板上，并要求机器处于水平位置以免离心时造成机器震动。3.2外接电源系统的电压要匹配，并连接可靠地线。3.3打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先平衡好的样品放置于转头样品架上（离心套管须原配，并与样品同时平衡），关闭机盖。3.4根据离心机功能，设置各项要求：速度、时间、温度、加速度及减速度等；带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆输入的各项信息。3.5按启动键，离心机将执行上述参数进行运作，到预定时间自动关机。3.6待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，如果操作过程中出现液体不慎泄漏，立即用软布蘸10%次氯酸钠或0.5%-1.0%施康液擦洗机腔内壁和转头，然后用70%酒精擦拭。冷冻离心机须待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。3.7离心过程中若发现异常现象，应关闭电源，报请有关技术人员检修。3.8定期查看电机碳刷，当其长度小于6mm时，须及时更换。附：相对离心力与每分钟转速的换算离心机的转速，在以前实验资料中一般以每分钟多少转来表示。现在国际资料中，已改用相对离心力（RCF）来表示。由于离心力不仅为转速函数,亦为离心半经的函数，即转速相同时，离心半经越长，产生的离心力越大。因此仅以转速表达离心力是不够科学的，近年来主张用相对离心力（RCF）来表示比较合理。两者互换公式如下：N=RCF×105/1.18×RRCF=0.011238095×R×NN表示转速，单位为转/分（r/min）。R表示离心半经，即离心管底端至轴心的距离，单位为厘米（cm）。RCF表示相对离心力，单位用重力加速度g(g=9.8m/s)。十一、恒温水浴箱操作使用程序1.目的： 保证水浴箱工作温度恒定。2.适用范围：DK—型电热恒温水浴箱3.标准操作：3.1水浴箱应置于坚固的水平台上，电源电压须匹配。3.2在水浴箱内注入清洁温水至总高度1/2～1/3处。3.3把电源开关拨至“开”处，控温仪面板即有数字显示表示电源接通，同时将水泵开关拨至“开”处。3.4把温度控制器的温度调节旋钮按下，此时数字显示的温度为设定温度，同时旋转此按钮，观察显示数值、选择所需工作温度。3.5松开温度调节旋钮此时数字显示的温度为水槽内测定温度，加热指示灯亮，仪器已进入自动恒温控制状态。3.6当水槽内测定温度达到设定温度时，加热中断、指示灯熄灭，再通电90分钟后，温度可保持稳定。3.7在每次水浴箱使用前，放入标准温度计同时监测实际水温，以校正温度。水浴箱工作温度波动范围应控制在：设定温度+/–1℃以内。3.8水浴箱正面外下壁贴有温度质量控制表，记录每天温度；如温度超出正常范围，该温度应划上红圈，并把修正操作记录下来。3.9水浴箱内外应保持清洁，外壳忌用腐蚀性溶液擦拭。3.10仪器不用时，需套好塑料薄膜防尘罩，以免温度控制器受潮影响使用。4．每半年矫正一次。 十二、加样器操作使用及校准程序1.目的：保证加样器加样的准确性。2.适用范围：各种品牌、型号的固定、可调式多通道加样器。3.操作步骤：3.1设定容量值根据所需取液量选择相应的加样器。可调式加样器应在允许容量范围内调节。连续可调式加样器容量计读数由三位拨号数字组成（显示所转移液体容量），从上（最大有效数字）至下（最小有效数字）读取；利用底部刻度可将容量刻度调节到更精确的分度。P型(Pipetman)加样器是连续可调的、计量和移液的专用仪器，量度准确、操作安全。P右下角数字为加样器最大容量值，代表加样器的型号已标明在按钮上。致密及粘稠液体对于密度低于水的液体，可将容量计的读数调到低于所需值来进行补偿。例如：加样器转移10μl血清。先将读数调到10μl，吸取后以重量法测定。如实测体积为9.5μl，即偏差0.5μl，则将读数调到10.5μl并重复一次。如第二次仍不够准确，根据偏差再作调整。排放致密或粘稠液体时，宜在第一停点多等一两秒钟再压到第二停点。3.2预洗当装上一个新吸嘴（或改变吸取的容量值）时应预洗吸嘴，先吸入一次液样并将之排回原容器中。预洗新吸嘴能有效提高移液的精确度和重现性。这是因为第一次吸取的液体会在吸嘴内壁形成液膜，导致计量误差。而同一吸嘴在连续操作时液膜相对保持不变，故第二次吸液时误差即可消除。3.3吸液 3.3.1首先选择一支合适的吸嘴安放在加样器套筒上。使用大体积加样器（如5000μl以上）时必须在套筒上加插一过滤芯，稍加扭转地压紧吸头使之与套筒间无空气间隙。未装吸头的加样器绝不可用来吸取任何液体。3.3.2把按钮压至第一停点；缓慢、平稳地松开按钮，吸液样。等一秒钟，然后将吸嘴提离液面。用药用吸纸抹去吸嘴外面可能附着的液滴。小心勿触及吸嘴口。3.4放液将吸嘴贴到容器内壁并保持100—400倾斜。平稳地把按钮压到第一停点。等一秒钟后把按钮压到第二停点以排出剩余液体。压住按钮，同时提起加样器，使吸嘴贴容器壁擦过。松开按钮。按吸嘴弹射器除去吸嘴。（只有改用不同液体时才需更换吸嘴。）3.5注意事项PCR实验室应备有3套连续可调式加样器(0.5—10μl、10—100μl、100—1000μl)，分别用于试剂准备、样品制备、扩增及产物分析三个实验区，加样器在使用时应注意以下几点：3.5.1在取液前所取液体应在室温（15—25℃）平衡；若吸液温度与室温不一致时将吸头预洗多次再用。注意移液温度不得超过70℃。3.5.2吸头浸入液体深度要合适，吸液姿势尽量保持不变。在吸取液体时应缓慢匀速吸取，避免液体溅到加样器头上；打出液体后不应松开按钮，将吸头压掉后再将拇指松开，避免液体回吸。3.5.3在调整取液量的旋钮时，不要用力过猛，并注意计数器显示的数值不要超过其可调范围。3.5.4连续可调式加样器在取样加样过程中应注意吸嘴不能触及其它物品，以免被污染；吸嘴盒、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作过程、避免污染为原则。3.5.5改吸不同液体、样品或试剂前要换新吸嘴；发现吸嘴内有残液时要换新吸嘴。新吸嘴使用前要预洗。3.5.6吸嘴内有液体时不可将加样器平放、倒转，以防液体进入加样器套筒内。3.5.7使用了酸或有腐蚀蒸气的溶液后，最好拆下套筒，用蒸馏水清洗活塞及密封圈；切勿用油脂等润滑活塞及密封圈。3.5.8连续可调式加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。3.5.9维护保养应及时记录，组长对记录应及时检查、核实。5．每三个月对加样器进行清洗一次，先用60%异丙醇擦洗，后用蒸馏水反复洗涤，去除异丙醇，晾干，在活塞处加一定量的润滑剂。每年一次送质量技术监督局校准。6．当杯或加样器有可污染时，在121℃压力下消毒20分钟。各区的加样器归各区专用（有标识），清洁和消毒时分别处理。十三、Millipore水纯化系统操作程序1.目的：保证Millipore水纯化系统的出水质量。2.适用范围：适用Millipore水纯化系统。3.操作步骤：3.1检查电源电压是否匹配后，并连接可靠地线。。3.2Millipore水纯化系统放置在制备区，要求环境清洁无灰尘。3.3超纯水系统中的离子交换柱对有机物有一定的吸附容量，经过一定的处理量之后，应加以更换。3.4活性炭柱和空气过滤器应该根据处理水量进行定期更换。3.5使用纯水作为供给水，可以大大延长纯化柱的使用寿命。3.6避免在终端滤膜后连接硅胶管或其他软管来取水，以免水质受到污染。3.7终端滤膜应定期进行更换。3.8打开电源，使机器处于prooperate状态，打开出水口开关，屏幕显示电阻率值为18.2MΩ，提示为纯水，可以用于细胞培养液体的配制。 十四、组织块培养法操作程序一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。二、概述：组织块培养法是常用的、简便易行且成功率较高的原代培养方法。可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。组织块培养法特别适合于组织量少的原代培养。（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例）三、操作步骤取材：打开胸腔，用无菌的剪刀和镊子，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用D-Hanks液冲洗3次，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块等。平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。剪切：将平滑肌组织放入小烧杯，用锋利的眼科剪反复剪切组织至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1~2滴培养液，以保持湿润。贴块：用吸管吸取无血清培养液加入到烧杯，反复轻轻吹打片刻，静置数分钟，吸出上清，剩下的组织小块即可用于培养。将剪切好的组织小块，用眼科镊送入培养瓶内，用弯头吸管将组织块均匀摆置，每小块间距0.5cm左右，组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内注入适量含10%牛血清培养液，盖好瓶盖。培养：将培养瓶瓶底朝上，37℃培养箱放置2~4h，待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，静置培养。换液：原代培养3~5d，需换液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞。组织块培养法也可不用翻转法，即在摆放组织块后，向培养瓶内仅加入少量培养液，以能保持组织块湿润即可，盖好瓶盖，放置37℃培养箱24h再补加培养液。注： 取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500~1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5~10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。组织块不易贴壁，可预先在瓶壁涂薄层血清、胎汁或鼠尾胶等。原代培养的1~2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。十五、消化培养法操作程序一、目的：学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。二、概述：此法采用消化分离法（即结合生化和化学手段把已剪切成小体积的组织进一步分散的方法），将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，可直接进行培养。分散后细胞易于从外界吸收养分和排出代谢产物，容易生长，成活率高，可以很快得到大量活细胞，细胞在短时间内可以生长成片。由于各种消化试剂的作用机制各不相同，要根据组织类型和培养的具体要求选择消化方法和试剂。本方法适用于培养大量组织，原代细胞产量高，但步骤繁琐，易污染。（本节以乳鼠心肌细胞培养为例）三、操作步骤取材：取新生1~3天的乳鼠，雌雄兼用，75%酒精消毒3次，用大头针将乳鼠固定在泡沫板上，无菌操作下打开胸腔，取出心脏，放入装有D—Hanks液的培养皿中。组织修剪、漂洗：修剪去除血管等杂组织，D—Hanks液中漂洗数次，以除去血块等。剪切：将心室肌放入小烧杯，用锋利的眼科剪反复剪切组织至剪成1~2mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1~2滴培养液，以保持湿润。用吸管吸取无血清培养液加入到烧杯，反复轻轻吹打片刻，静置数分钟，吸出上清，剩下的组织小块即可用于消化。消化：将组织小块转移至100ml的玻璃瓶中，再加入30~50倍组织量并预温37℃的0.08%胰酶消化液，37℃摇床消化6min左右。细胞分离：消化完毕，用吸管轻轻吸吹几下，使组织小块散开，静置2min后，吸取上面的混悬液，弃去第1次的混悬液，经140目尼龙网膜过滤至盛有终止液试管中，1000rpm，离心10分钟，弃去上清，加适量的培养液悬混。在装有组织小块的玻璃瓶中再加加入30~50倍组织量并预温37℃的0.08%胰酶消化液，重复第4、5步骤，直至大部分组织小块消失。细胞计数：将上述获得的细胞悬液，吸出少许，适当稀释，加台盼蓝溶液染色，用红血球计数板计数活细胞和死细胞，计算细胞密度和存活率。细胞接种：将细胞接种至30ml的培养瓶中，每瓶6×105，用含15%小牛血清的MEM培养液培养。培养：5%CO2、37℃培养箱培养12h，显微镜下可见细胞贴壁，呈多角形，培养24h，镜下见细胞已连结在一起，部分细胞开始搏动。换液：培养3~5d，细胞换液。注取材的组织最好尽快培养。因故不能即时培养，可将组织浸泡于培养液内，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果组织块很大，应切成1cm3以下的小块再低温保存，但时间不能超过24h。从消化道、周围有坏死组织等污染因素存在的区域取材，可用含500~1000u/ml的青、链霉素BSS液漂洗5~10min，或用10%达克宁注射液冲洗浸泡10min再作培养。原代培养的1~2d内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除。十六、细胞传代操作程序一、目的：学习细胞传代方法，扩增细胞，建立细胞系。二、概述：培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。三、操作步骤贴壁细胞的消化法传代：1.吸除或倒掉瓶内旧培养液；2.D-Hanks液洗2-3次；3.向瓶内加入适量消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加适量新的消化液，轻轻摇动再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。也可不采用上述步骤直接加消化液进行消化。4.消化最好在37℃或室温25℃以上环境下进行。消化2～5min后把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化。5.吸除或倒掉消化液，如用EDTA消化，需加Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如仅用胰蛋白酶可直接加少许含血清的培养液，终止消化。6.用弯头吸管，吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一边结束，以确保所有底部都被吹到。吹打时动作要轻柔不要用力过猛，同时尽可能不要出现泡沫，这些都对细胞有损伤。细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。7.计数，分别接种在新的培养瓶内。悬浮细胞的传代悬浮细胞传代可离心收集细胞后传代，或直接传代。离心法传代：将细胞连同培养液一并转移到15ml离心管内；离心800～1000rpm，5min；弃去上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打形成细胞悬液；计数，分别接种在新的培养瓶内。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清液吸掉1/2～2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后再传代。(三)部分贴壁细胞的传代部分贴壁不牢的细胞，如Hela细胞等，不经消化处理直接吹打可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。对绝大部分贴壁生长的细胞，因直接吹打对细胞损伤较大，细胞常有较大数量的丢失，因而需消化后，才能吹打传代。注：1．胰蛋白酶要预温，温度37℃左右为宜，温度过高，胰蛋白酶失活，温度过低，胰蛋白酶活力低下。2.离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。3.要定时观察细胞，发现污染，应及时处理。十七、细胞冻存和复苏操作程序一、目的：学习细胞冻存和复苏的方法，掌握长期保存培养细胞的技术。二、概述：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在–70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达–196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。三、操作步骤（一）细胞冻存1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2.取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；3.离心1000rpm，5min；4.去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5.将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5ml；6.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2小时，-70℃冰箱过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。细胞复苏从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；离心，1000rpm，5min；弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；次日更换一次培养液，继续培养。注：1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液；2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。十八、细胞生长曲线操作程序一、目的学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。二、概述：细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。三、操作步骤1.取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；2.计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。3.每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养3～5d常要给未计数的细胞换液。4.以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。注：细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，从曲线上换算出。十九、四唑盐试验比色试验操作程序一、目的学习四唑盐比色试验（MTT），检测细胞存活和生长情况。二、概述： 四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。三、操作步骤1.接种细胞：用0.08%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。2.培养细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下，培养3～5d。（培养时间取决于实验目的和要求）3.呈色：培养第3～5d后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20ul，37℃