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实验6乳酸脱氢酶的活性测定

1.1、任务背景乳酸脱氢酶〔LDH〕是催化乳酸和丙酮相互转化的同工酶，属于氢转移酶。该酶存在于所有动物的组织中，在肝脏中活性最高，其次为心脏、骨骼肌、肾脏，在肿瘤组织及白血病细胞中也能检测到。在大多数动物组织中，它是由两种肽链按一定比例组成的5种四聚体。它的每条肽链各由一个基因编码，经转录、翻译、修饰加工等过程，最后成为有生物学活性的物质。不同的动物，不同的组织或器官在不同的发育阶段或不同的生活周期均有其特异性的同工酶酶谱。2、任务目标①掌握LDH活性测定原理；②学习用比色法测定酶活性的方法。3、工作原理乳酸脱氢酶〔lactatedehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27,L－乳酸：NAD+氧化复原酶〕广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化以下可逆反响。2.LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH,NAD+在340nm及260nm处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，参加一定量酶液，观察NADH在反响过程中340nm处光吸收减少值，减少越多，那么LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中LDH单位。定量测定蛋白质含量即可计算比活力〔U/mg〕。利用上述原理，改变不同基质液可测定相应脱氢酶反响过程中A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等，适用范围很广。3.实验步骤1〕制备肌肉匀浆称取1g鸡肌肉,剪碎，置10ml离心管中，编号；参加4℃预冷的0.01mol/LpH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液4ml；匀浆，每次10s，连续3次。放置10min，3000r/min，离心5min。4.实验步骤2〕LDH活力测定取1只比色杯中参加0.1mmol/LpH7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零。取1只比色杯，依次参加丙酮酸钠溶液2.9ml,NADH溶液0.1ml，加盖摇匀后。参加经稀释的酶液10μl，加盖摇匀后，在A340nm，连续测定3min，以A对时间作图，取反响最初线性局部，计算A340nm/min减少值。

注意：参加酶液的稀释度〔或参加量〕应控制A340nm/min下降值在0.1－0.2之间。5.实验步骤3〕数据处理计算每毫升组

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