犬脊髓损伤的组织病理学观察

犬脊髓损伤的组织病理学观察摘要目前，国内兽医一般根据以下症状做出腰椎间盘突出的初步诊断：尾巴下垂，背部拱起，不愿动，约束不严，步幅不稳，后肢不灵活，食欲欠佳，触诊局部腰椎敏感，疼痛反应可，腹肌紧张板硬，个别狗头后仰。但无法准确判断脊髓损伤的确切程度。本研究的目的是比较病变脊髓与健康脊髓的组织病理学方面，了解椎间盘突出所致脊髓损伤的程度，并为研究的后期做好准备。关键词：犬脊髓损伤脊髓血流针刺式探头激光多普勒监测仪目录TOC\o"1-3"\h\u1绪论 绪论1.1研究背景和意义急性脊髓损伤是一种高度致残的中枢神经系统损伤性疾病，是目前世界上急诊医学，神经外科，骨科和医疗修复领域最棘手的问题之一。目前，国内兽医一般根据以下症状做出腰椎间盘突出的初步诊断：尾巴下垂，背部拱起，不愿动，约束不严，步幅不稳，后肢不灵活，食欲欠佳，触诊局部腰椎敏感，疼痛反应可，腹肌紧张板硬，个别狗头后仰。但无法准确判断脊髓损伤的确切程度。中国现有的SCI患者保守估计约为100万人，每年增加10000人。各种致SCI事故中存活并能被紧急送往急诊室的患者死亡率为4.4%~16.7%。这些幸存者长期在急诊医院和康复中心住院治疗。虽然死亡率显著下降，但大多数SCI病例留下了生活质量差或无法自理的后遗症。人们需要花费大量的人力、物力和金钱在医疗和康复上。因此，对SCI的研究迫在眉睫。本研究的目的是比较病变脊髓与健康脊髓的组织病理学方面，了解椎间盘突出所致脊髓损伤的程度，并为研究的后期做好准备。1.2研究内容本实验研究旨在利用针刺式探头激光多普勒（NeedleProbe—LaserDopplerFlowmetry，NP—LDF）探讨一种实时监测不同区域脊髓血流的方法，并观察冲击脊髓损伤急性期脊髓血流的规律，希望为临床急诊更多的治疗策略提供初步的理论依据。2犬脊髓损伤的组织病理学观察2.1材料和方法2.1.1材料EQ\o\ac(○,1)实验动物及饲养8只1～2岁实验用比格犬，体重10～12.5kg，雌性，所有动物由附属医院实验中心提供并饲养。室内温度约为25℃左右，空气湿度40%～50%。实施手术前先进行适应性饲养1周。EQ\o\ac(○,2)主要实验仪器和试剂（1）动物实验台、严格无菌脊柱外科手术常规器械1套，显微外科器械1套，ForceFX-8C型高频电刀，由中国人民解放军总医院第一附属医院动物实验室提供。（2）RM-6008型8道生理记录仪日本光电（3）数控电机撞击装置：工作原理见图2-1301医院骨科研究所提供（4）Moor-VMS激光多普勒血流监测仪英国Moor公司（5）针刺式单光纤维探头英国Moor公司（6）Cascade16通道术中电生理监护仪CadwellLaboratories,Inc（7）BL-1型手术放大镜上海精密仪器仪表有限公司（8）冰冻切片机、光学显微镜附属医院病理科（9）异丙酚西安杨森制药（10）15%异氟醚上海雅培公司（11）青霉素哈药集团制药总厂2.1.2方法EQ\o\ac(○,1)实验分组实验中，8只比格犬根据随机数表随机分为两组：对照组2只和SCI组6只。成功模拟SCI组实验动物并进入实验。图2-1：数控电机撞击装置制造创伤性脊髓损伤模型工作原理示意EQ\o\ac(○,2)手术所有动物术前8～12小时禁食水，做好背部及腹部皮肤准备。每只动物称重6mg/kg静脉注射异丙酚进行诱导麻醉。采用15%异氟醚混合浓度约1.0～1.5l/min氧气进行气管插管吸入麻醉。监测狗的肛门温度、经皮血氧饱和度（钳夹狗舌）。打开左股静脉通路进行术中补液，右股动脉插管用压力传感器，连接RM-60088通道生理记录仪记录平均动脉压，心率等。由于手术时间长，整个手术过程，动物呼吸机辅助呼吸，频率约为15次/min。麻醉成功后，动物的温度保持在36.5°C至37.5°C左右，使用保温毯。高频电刀负极板粘贴至动物腹部。取俯卧位并将四肢固定在动物手术台上，背部用毛巾消毒，选择胸廓12-胸廓13（T12-13）为阳性中心，做出长度约8cm后的正中切口，依次切开皮肤，浅筋膜及冈上韧带，电刀止血，钝性剥离双侧椎旁肌肉暴露棘突，双侧椎板及小关节。脊髓后部结构用微椎板咬钳切除，暴露硬膜外。暴露范围约为1厘米上下在上关节过程的顶点在T13。清晰观察脊髓边缘和脊髓后正中线，确保直径为6mm的CNC运动冲击头能通过（见图2-2）。所有SCI组动物均采用余潘峰实验方法进行SCI建模。采用余潘丰法对数控电机的冲击参数进行了严重破坏，即冲击速度为1.0m/s，冲击深度为6mm，压缩深度为6mm，压缩时间为10min（1.0m/s，6mm，10min）（见图2-3）。对照动物未接受脊髓损伤治疗。观察脊髓血流指数后，闭合切口。EQ\o\ac(○,3)术后管理所有动物清醒后，放入动物饲养笼中。术后3天内每只狗补充0.9%生理盐水250ml/d，动物每天进行两次膀胱按摩挤压，帮助其排尿，防止尿路感染。必要时为有排尿困难的动物留置导尿管。术后喂动物少量食物，易消化为主，每隔1天给予蓖麻油，花生油等植物油10~20ml/次，帮助软化粪便，保持肛门干燥。在实验动物中进行下肢按摩以防止水肿。更换切口2次/1天，常规给予青霉素4³106U肌注，每天1次，连续3d，预防切口感染。所有动物使用丁丙诺啡（0.05mg/kg，2次/d）于术后48h内肌肉注射止痛。EQ\o\ac(○,4)实验指标检测（1）SCBF监测对SCI组动物进行脊髓暴露SCBF监测，SCI后5min，SCI后60min，7d，3w；对照组动物对SCI组动物的时间点进行监测。SCBF监测操作过程参考和预实验：使用直径为0.46mm的单个光纤探头固定在CNC冲击装置上，连接到Moor-VS激光多普勒流量监测仪上。采用显微手术器械，对硬脑膜和软膜进行顺序切割。暴露范围约0.5毫米上下在关节过程顶部的T13（见图2-4）。启动运动，将探头放置在脊髓中线（正中动脉后）的右侧，以避免后正中动脉的小分支垂直进入脊髓（见图2-5），并刺入腹脊髓，直至不能穿透腹面硬膜外，确认探针来源。固定静止后，记录血流值。根据文献报道的犬脊髓不同区域的最佳测量深度，将探针向后退1mm，测量腹侧白质区血流；再向后退2mm，测量中心灰色区血流；最后向后退3mm，测量背侧白质区血流。测量完成后，取出探头，缝合硬脑膜（见图2-6）。图2-2：术中暴露脊髓图2-3：数控电机对脊髓进行撞击图2-4：显微外科器械依次切开图2-5:NP-LDF刺入硬脊膜及软脊膜脊髓进行SCBF值监测图2-6：手术结束后对硬膜进行缝合图2-7：神经电生理监测（2）神经电生理监测两组动物术后1d、7d、3w的神经电生理监测包括：SEP和MEP。根据StephenJP等人报道的方法，使用级联16通道术中电生理监测仪对SEP进行监测，其中刺激电极嵌入犬后肢跟腱后皮下，记录电极皮下埋在犬颅骨顶部，参考电极皮下埋在前肢接地。脉冲电压刺激狗的胫后神经，刺激标准：引起狗的后肢抖动。参数控制：强度：5mA恒流，频率：3Hz，模式：P-N-P，叠加刺激300次后开始记录波形。根据Wilson-Holden和其他报告方法。记录电极嵌入C3-C4水平皮下；刺激电极嵌入双侧腓肠肌后部，强度：50V，记录波形后信号叠加：300次；参考电极埋于下跟腱位置（见图2-7）。（3）TSCIS评估犬行为学根据GwendolynJ所阐述的TSCIS所有两组动物均在术后1d、7d和3w上进行评级。两名实验目的不明的观察者和各组根据评分标准进行评分（见表2-1）。平均值重复三次。表2-1：犬的TSCIS评分标准内容评分步态肢体未见任何自主活动0肢体彻底伸直时不能见离地间隙1肢体彻底伸直时间断见离地间隙2肢体彻底伸直时见有持续的最小离地间隙（离地时间超过75%）3能行走，肢体能持续离地，行走期间有中度轻瘫—共济失调现象（偶尔跌倒）4能行走，肢体能持续离地，行走期间有轻度轻瘫—共济失调现象（光滑地面也不会跌倒）5正常步态6本体感觉没有反应0反应迟钝1反应正常2伤害知觉深伤害未见知觉反应0深伤害知觉反应，未见浅表伤害知觉反应1深伤害知觉和浅表伤害知觉反应正常2（4）组织学观察根据随机数字表法，在7d和3w后随机选择SCI组的实验动物。所有试验结束后，给予丙泊酚12mg/kg剂量静脉注射进行深度麻醉。动物被放置在动物操作台上，有一个向下推的位置。常规消毒巾用脊髓手术器械暴露T12-T13段脊髓后，注射100ml空气杀死动物。固定后常规进行脱水，透明，浸蜡，包埋，切片。切片厚度约为4μm，用苏木精伊红染色。切片过程由医院病理科完成。两名资深病理学家在光学显微镜下盲目读取胶片，以观察HMIAS-2000分析仪拍摄的病理组织变化。2.1.3统计学分析计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示，两组数据比较根据数据是否符合正态分布情况采用t检验或非参数检验，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA),两两比较采用LSD或Tamhane’sT2方法进行，以P<0.05为差异有统计学意义。所有数据采用SPSS17.0软件进行记录和分析。2.2结果2.2.1动物模型情况有8只实验动物进入实验，其中对照组1只犬，SCI组2只犬分别于术后第5，第4和第4天出现切口感染。考虑到术后动物的安全性，保证实验的顺利进行，所有实验动物在术后第五天给予头孢美拉唑钠0.5g，1次/d，静脉滴注，连续使用3天。其中，SCI组中的两只狗分别于第8天和第12天死亡。考虑到实验的完整性，增加了两只狗进行补充实验。对照组动物术前术后均有相同的脊髓损伤症状。所有SCI组动物均成功建模。所有动物后肢无自主运动，后肢肌肉萎缩。狗只能在前腿上移动（见图2-8）.。对照组在脊髓暴露时、术后5min、术后60min、术后7d、术后7d和术后3w记录中枢灰质、腹侧白质和背侧白质的SCBF值（见表2-3）。脊柱暴露时，中央、腹侧和背侧白质两组的白质SCF值无显着性差异（P>0.05）。所有动物中央灰质区SCBF值与腹侧白质区、背侧白质区比较差异具有统计学意义（P<0.05）；腹侧白质区与背侧白质区比较差异无统计学意义（P>0.05）。对照组SCBF无明显差异（脊髓暴露后5min，术后60min，术后7d，术后3w）（P>0.05）。对照组在术后第5min、第60min、第7d、第3w与SCI组在中央灰质、腹侧白质、背侧白质的SCBF值比较差异均具有统计学意义（P<0.05）（见表2-4）。SCI组动物脊髓中央灰质、腹侧白质、背侧白质：脊髓暴露时与术后第5min、第60min、第7d、第3wSCBF值比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；术后第5min与术后第60min、第7d、第3wSCBF值比较差异均具有统计意义（P<0.05）；术后第60min与术后第7d、第3wSCBF值比较差异均具有统计学意义（P<0.05）；术后第7d与第3wSCBF值比较差异无统计学意义（P>0.05）。SCI组实验动物脊髓中央灰质、腹侧白质、背侧白质SCBF值在术后第5min小幅度升高（11.55%、9.02%、18.33%）后随着受损时间快速下降，并且术后第7d与第3w未见明显变化（见图2-10）。表2-2：对照组动物脊髓各区域SCBF值（Mean±SD）,单位：PU脊髓区域中央灰质腹侧白质背侧白质脊髓暴露时338.55±19.73260.05±15.63＃235.70±14.70＃术后第5min330.41±17.21251.02±10.23＃243.81±13.74＃术后第60min347.23±19.23253.74±17.93＃240.56±19.62＃术后第7d329.11±20.43266.12±9.13＃270.27±14.10＃术后第3w339.19±18.56271.45±11.52＃260.12±13.23＃注释：P＃＜0.05：中央灰质与腹侧白质比较；P*＜0.05:中央灰质与背侧白质比较表2-3：SCI组动物脊髓各区域SCBF值（Mean±SD）,单位：PU脊髓区域中央灰质腹侧白质背侧白质脊髓暴露时329.34±16.73266.07±23.63○240.70±17.70□术后第5min367.01±14.21&290.02±17.24○&284.41±10.74□&术后第60min229.20±10.23Ï.74±17.94○Æ.54±14.62□&#术后第7d65.14±22.43&#△101.23±9.03○&#△62.43±17.10□&#△术后第3w72.14±17.50&#△*94.45±11.72○&#△*68.80±12.20□&#△*注释：时间分组比较：P&＜0.05:与脊髓暴露时比较；P＃＜0.05：与术后第5min比较；P△＜0.05与术后第60min比较；P*＞0.05:与术后第7d比较。脊髓区域分组比较：P○＜0.05:中央灰质与腹侧白质比较；P□＜0.05：中央灰质与背侧白质比较。表2-4：对照组与SCI组脊髓各区域SCBF值（Mean±SD）比较，单位：PU脊髓区域中央灰质腹侧白质背侧白质脊髓暴露时对照组338.55±19.73266.05±15.63235.70±14.70SCI组329.34±16.73*266.07±23.63*240.70±17.70*术后第5min对照组330.41±17.21251.02±10.23243.81±13.74SCI组367.01±14.21#290.02±17.24#284.41±10.74#术后第60min对照组347.23±19.23253.74±17.93240.56±19.62SCI组229.20±10.23#207.74±17.94#198.54±14.62#术后第7d对照组329.11±20.43266.12±9.13270.27±14.10SCI组65.14±22.43#101.23±9.03#62.43±17.10#术后第3w对照组339.19±18.56271.45±11.52260.12±13.23SCI组72.14±17.50#94.45±11.72#68.80±12.20#注：P＃＜0.05：术后SCI组与对照组比较；P*＞0.05：脊髓暴露时SCI组与对照组比较图2-10：SCI组动物脊髓血流在各测量时间点所测量的SCBF值变化趋势图；Y轴：脊髓血流值，X轴监测时间点；2.2.2神经电生理结果SCI组所有动物在第1d、第7d、第3w进行SEP及MEP监测未见到规律潜伏期及波幅（见图2-11、2-12）图2-11：SCI组犬只MEP未见任何波形记录图2-12：SCI组犬只SEP未见任何波形记录2.2.3TSCIS评分结果对照组：所有狗的tscis评分为20分，表明后肢神经行为无异常；SCI组的1dtscis评分为0分，两只狗的后肢在7d上的损伤感知项中评分为1分，其中一只狗的后肢在损伤感知项中评分相同（见图9）。无统计学意义差异(P＞0.05)（见表5）。表5:两组动物TSCIS评分:(Mean±SD)分组TSCIS评分术后第1d对照组20±0SCI组0±0术后第7d对照组20±0SCI组0.33±0.52术后第3w对照组20±0SCI组0.33±0.582.2.4组织学观察组织学显示：脊髓大部分在SCI组后7d失去正常脊髓组织，中心灰质坏死逐渐被巨噬细胞吞噬，多囊腔小，周围白质也显示坏死（见图2-13，2-14），中央灰色区进行性加重出现一大囊腔，周围白质坏死带物质也被巨噬细胞吞噬，胶质细胞逐渐充满囊腔内（见图2-15、2-16）。图2-8：SCI组动物后肢瘫痪图2-9：对犬只进行TSCIS评分图2-13：SCI组SCI后第7d脊髓损伤标本图2-14：SCI组SCI后第7d脊髓损伤标本（4*10）（20*10）组织学显示：脊髓大部分脱离正常脊髓组织，中心灰质坏死逐渐被巨噬细胞吞噬，多囊腔小，周围白质也坏死。图2-15：SCI组SCI术后第3w脊髓标本图2-16：SCI组SCI术后第3w脊髓标本（4*10）（20*10）组织学显示：脊髓完全脱离正常脊髓组织，中央灰色区逐渐加重伴有大的囊腔，周围白质坏死带物质也被巨噬细胞吞噬，囊腔内逐渐充满胶质细胞。图2-17：预实验中NP-LDF刺入脊髓前后图2-18：预实验中NP-LDF刺入脊髓前后SEP检测结果MEP检测结果2.3讨论2.3.1NP-LDP评估SCBF的方法研究监测SCBF在临床上往往是重要的，因为它是必要的关闭动脉，然后减少脊髓的血流。如果脊髓缺血再灌注损伤在夹闭期能影响脊髓功能，大多数基本动物实验都采用SCI模型研究了SCBF的变化。因此，SCBF监测的一些方法已经被开发并应用于这些实验研究，如清除氢，放射性示踪微球，LDF，C14放射自显影和活力组织监测系统。但这些技术有其自身的局限性。为了满足实验要求，我们使用Moor-VM-LDF及其匹配的针刺型单光纤探针（直径0.46mm）对冲击SCBF进行了监测，利用各自的优势和劣势组成NP-LDF。LDF可满足SCBF的实时连续监测，针式单纤维探针（NP）可插入脊髓进行不同区域的SCBF监测。我们使用NP-LDF监测对照动物的SCBF值，与先前研究的结果一致。表明脊髓SCBF监测中的NP-LDF是可行的，如图7所示，SCBF监测和固定探针可以连续实时监测SCBF。为了确定单光纤维探针渗透到脊髓是否影响脊髓功能，在文献和我们的预实验中验证了探针的安全性：我们使用NP-LDF测量空白对照动物的SCBF，没有SCI模型，MEP和SEP检测实验动物在测量1周前和测量后，并同时进行TSCI评分。结果：tscis评分均为满分20分，SEP和MEP的潜伏期和振幅无明显变化（见图2-17，2-18）。结果表明，单光纤维探针不会对中型和大型动物造成脊髓损伤，NP-LDF对SCBF的实时监测是可行的。临床上，神经外科立体定向治疗仪使用2mm或4mm的导管刺入脑实质，专门清除血肿，这一技术也表明，微妙的针刺不会造成神经损伤。本研究结果规模较小，需要大样本实验证明。因此，这一理论仍有一些缺陷，就像氢的分裂一样，可能会受到质疑。2.3.2NP-LDF对撞击性SCI脊髓中央灰质、腹侧白质、背侧白质SCBF的监测研究急性期冲击脊髓的主要病理变化是中枢灰质出血，对SCBF的血流有一定的影响。中密度纤维板测量SCBF为相对值PU，而不是其他方法提供的血液灌注绝对值：ml/min/100g。PU是单位体积平均红细胞浓度和红细胞移动平均速度的乘积，因此出血区无流动性的血细胞不会影响SCBF值。在具有良好PU值的组织中，微循环血流的发生率可以充分解释冲击性脊髓脊髓微循环的灌注。本实验采用SCBF对不同部位的脊髓进行穿刺监测。如果探针已经在每个监测组织内，则无需增加检测深度，以避免被监测的SCBF值不清楚地代表某一区域。单光探头直径较小，刺入脊髓时不会对脊髓造成不规范的损伤，影响实验结果的准确性。插入脊髓的NP过程会导致脊髓收缩，导致脊髓受到NP的压迫。在测量SCBF时，我们切割硬膜外，降低硬膜外对探针的阻力，并使用CNC运动直接将NP刺入脊髓腹面，以避免推进过程对脊髓的影响。为了确定脊髓面积，余潘峰等人。用病理切片测量犬脊髓标本的矢状直径，确定中心灰质、腹侧白质和背侧白质的相对区域，这对于指导测量深度所代表的区域是科学的。然而，仍然需要大量的样本研究来确定其真正的科学性质。2.3.3撞击性SCI的SCBF变化与脊髓功能、组织学的关系本研究建立了冲击SCI模型，研究SCBF的变化。我们的实验结果是SCBF在SCI后第5min增加，中心灰质、腹侧白质和背侧白质比基值增加11.55%、9.02%、18.33%，差异有统计学意义（P＜0.05）。这与许多研究报道在SCI模型中SCBF的变化下降且下降幅度超过50%的结论不符合。我们根据文献报道的方法，使用数控冲击装置模拟重物对脊髓的坠落损伤，这与Lavery的实验方法相似。脊髓创伤后SCBF的变化是否导致脊髓缺血仍存在巨大争议。争论的重点是脊髓损伤的严重程度，以及SCBF的位置是否是SCI后脊髓损伤的部位，以及SCI后全身血压的变化。在本实验过程中，我们发现不仅灰色血液增加，而且白质血液也增加。灰质充血，SCBF增加已上报，但白质充血未上报。我们分析了以下可能的原因：（1）由于身体系统血压和组织灌注增加而引起的创伤引起的整个应激反应；（2）我们测量了硬膜和软心包的切口，在切口过程中可能对周围软骨膜下的白质造成轻微损害，触发微循环和脊髓血管的舒张，预先导致白质充血；（3）虽然对照组实验动物暴露于脊髓时脊髓血流量无明显增加，但对照组只有2只犬，样本量过少，可能导致结果偏差。针对实验结果，应增加样本量，尽量减少后期术中干扰，并进行连续脊髓标本切片，观察生化因素，验证实验结果。2.3.4撞击性SCI的SCBF变化对SCI急诊救治的临床意义结果表明，冲击脊髓的中枢灰质及周围白质的血流变化与脊髓低度神经中枢功能障碍和上下神经传导障碍的SCI患者的临床症状一致。脊髓神经功能障碍的持续进展和恢复困难与脊髓中枢结构神经细胞无法耐受缺血缺氧的特征有关。这种继发性损伤伴随着原发性损伤。鉴于冲击SCI后脊髓功能的残留和恢复主要取决于继发性损伤的发生和发展的控制，应在短时间内干预，以阻断继发性损伤级联反应的进展。但在SCI治疗过程中，我们的急诊作用是第一站，忽视了二次损伤的干预，错过了SCI患者的黄金抢救时间，造成了不可挽回的损害。伤后6-8小时是手术治疗的黄金期，但由于现场治疗，转诊，影像学检查，手术安排等因素，只有少数患者可以进行手术，据不完全统计，伤后8小时可手术的患