分子生物学诊断

第十章临床分子生物学诊断

〔ClinicalMolecularBiologyDiagnosis〕整理课件学习内容了解流式细胞术及染色体检测在临床中的应用熟悉分子生物学常用技术及在临床诊断中的地位掌握基因诊断的定义及在临床诊断中的应用〔重点〕整理课件分子生物学概念在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面内容，说明各种生命现象的本质。正常生命现象－本质

疾病－诊断整理课件

运用分子生物学的理论和技术，对来自人体的血液、骨髓、体腔液、排泄物、分泌物和组织细胞等标本进行各种检测，获得有关病原体、核酸及蛋白质改变等方面的实验信息，为疾病诊断、治疗方案选择、疗效监测、预后评估等提供客观依据，并为疾病的防治、健康普查与咨询等做出正确的评价。临床分子生物学检测概念整理课件GeneDiagnosis第一节基因诊断整理课件

以DNA或RNA为检查对象，应用分子生物学技术，通过检查基因的结构或表达量的改变，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。遗传物质可以是外源性基因，也可以是内源性基因。一、基因诊断的定义：整理课件基因诊断的主要内容基因突变分析基因连锁分析基因表达分析病原体诊断整理课件表型诊断（传统方法）基因诊断（一）诊断依据

疾病表型变化基因结构异常和表达异常（二）分类

血液学诊断生化学诊断免疫学诊断微生物学诊断DNA诊断RNA诊断（三）特异性

表型改变在很多情况下是非特异性的利用分子杂交原理具有很高的特异性（四）敏感性

相对较低诊断灵敏度高，标本只需微量，DNApg水平即可（五）早期诊断

因为表型改变往往出现较晚，难以早期诊断在表型改变之前，基因结构或表达已发生改变，故往往可以早期诊断。二、基因诊断在诊断学中的位置整理课件基因诊断的根底是医学根底，专业根底是医学分子生物学和医学遗传学，不同的是我们在基因水平上研究：基因结构〔解剖〕、基因转录翻译等〔生理〕、基因结构异常〔病理〕，基因表达异常〔病生〕，然后主要应用分子生物学技术手段进行基因诊断。基因诊断遵循诊断学的根本原那么基因诊断是诊断学的续写，是诊断学的新篇章整理课件染色体数量变异：包括整倍体和非整倍体染色体结构变异：染色体在体内外因素作用下，发生断裂

和愈合过程中的异常改变。三、遗传变异缺失：指染色体局部丧失，主要有末端和中间缺失两种倒位：指一条染色体发生两处断裂，中间局部颠倒顺序再连接易位：某个染色体断片位置移到另一处或另一个染色体的新位 置上插入：两处断裂产生的中间一段染色体转移到同一染色体或另 一条染色体的一个断裂处并重新连接重复：染色体中增加的额外染色体成分，是染色体个别区带或 片段的重复整理课件１．转换：指DNA上发生的单个碱基的置换，一种嘌呤被另一种嘌呤所置换；或一种嘧啶被另一种嘧啶所置换。２．颠换：指一种嘌呤被另一种嘧啶所置换，或一种嘧啶被另一种嘌呤所置换。３．缺失：指DNA链被删除一个或多个碱基对，常引起严重的表型改变。４．插入：指DNA链中插入一对或几对碱基。四、基因突变指DNA中核苷酸排列顺序或组成发生的变化〔一〕按基因突变性质划分突变可分为长度变化和点突变，后者又分为两种：转换和颠换整理课件1．错义突变：DNA中核苷酸发生置换后，改变了遗传密码，使一种氨基酸变成另一种氨基酸，影响到所合成蛋白质的结构和功能。2．无义突变：当DNA突变后，使原来编码某一氨基酸的密码子变成终止密码子时，多肽链停止合成，提前释放出不完全的蛋白质，造成功能丧失。3．同义突变：指由于遗传密码是兼并的，决定一种氨基酸的密码子常常不止一个，因此DNA中某些碱基置换只造成三联密码中第三个核苷酸发生改变，不改变氨基酸。4．移码突变：即DNA链中插入或缺失一个或多个碱基对后，使读码格式发生改变，自突变点3’方向以后的一系列密码都改变，造成肽链大范围错误。〔二〕按基因突变结果划分根据突变发生的位置和突变性质，会使遗传密码的阅读框和蛋白质翻译发生变化，可分为：整理课件五、基因诊断常用技术核酸分子杂交DNA序列测定聚合酶链反响连接酶链式反响单链构象多态性分析限制性片段多态性分析单核苷酸多态性DNA芯片技术Southern、Northern印迹杂交、斑点杂交、原位杂交整理课件〔一〕核酸分子杂交技术核酸分子杂交是指两条互补单链核酸〔DNA或RNA〕在一定条件下按碱基互补原那么退火形成双链的过程特点：分子杂交的根底是碱基对之间非共价键形成稳定的双链区杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA之间进行都采用了同位素或非同位素标记的探针整理课件待测核酸制备滤膜上核酸固化杂交去除未参与杂交的探针检测杂交信号制备探针核酸片段探针标记参加标记核酸探针核酸分子杂交的流程示意图整理课件1.Southern印迹法是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行分子量大小测定，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。主要步骤：不同来源DNA样品〔限制性内切酶切割〕凝胶电泳别离碱变性使DNA解离成单链毛细管虹吸或电转移法到硝酸纤维素膜洗涤、凉干、80℃烤箱中加温2小时用于杂交探针于100℃变性处理显色整理课件斑点杂交结果2.Northern印迹法用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析同Southern杂交注意RNA酶的处理电泳须在含甲醛或乙二醛的变性凝胶中进行主要步骤：3.斑点杂交DotBlotting

用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高。整理课件组织或细胞的原位杂交，是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，并可显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。4.原位杂交InSituHybridization

整理课件确定DNA双股链上每一个独立结构单元或碱基确实切顺序的过程〔二〕DNA序列测定DNA测序的方法链终止法测序化学降解法测序自动化测序〔DNASequencing〕整理课件1、链终止法测序根本原理:在合成与单链DNA互补的多核苷酸链时，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反响，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而可读取待测DNA分子的顺序。整理课件O碱基CPOHH12345O碱基CPOHH12345OHO碱基CPOH12345O碱基CPOHH12345H2O脱氧核苷酸的连接整理课件双脱氧核苷酸不能连接O碱基CPHH12345O碱基CPOHH12345OH整理课件制备单链模板↓将单链模板与引物退火↓参加DNA多聚酶及4种脱氧核苷酸 ↓分别参加少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反响产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列技术路线整理课件四套反应体系1--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATP2--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCTP3--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTP4--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTPATGCGGTACCAT5’3’测序模板5’

TA5’TACGCCA5’TACGCCATGGTACCC第一套反应第二套反应5’5’5’整理课件AGCTATGGTACCGCAT整理课件2、化学降解法测序根本原理:在选定的核苷酸碱基中引入化学基团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解。双链DNA变性为单链

↓同一方向末端标记，以显示DNA条带

↓不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体↓电泳,读取DNA核苷酸顺序技术路线:整理课件碱基特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对N7进行甲基化,使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/LNaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶Maxam-Gilbert法所用的化学技术整理课件哌啶化学法测序实例整理课件3、自动化测序根本原理:与链终止法测序原理相同，只是用不同的荧光素分别标记ddNTP，如ddATP标记红色荧光，ddCTP标记蓝色荧光，ddGTP标记黄色荧光，ddTTP标记绿色荧光。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色，而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。整理课件整理课件整理课件〔三〕聚合酶链式反响类似于DNA的天然复制过程，扩增产物大小依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物模板DNA的变性：94℃数分钟，双链解离成单链模板DNA与引物退火：55℃左右，引物与模板DNA互补序列结合引物的延伸：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反响原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的新链PCR〔体外核酸扩增技术〕根本原理：PCR由变性--退火--延伸三个根本反响步骤构成：〔PolymeraseChainReaction，PCR〕整理课件特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR〔体外核酸扩增技术〕特点：整理课件变性退火延伸百万倍扩增整理课件PCR技术已广泛应用整理课件〔四〕连接酶链式反响连接酶链反响，是一种新的DNA体外扩增和检测技术程序：在模板DNA、DNA连接酶、寡核苷酸引物存在条件下，加热94℃变性，双链翻开，然后降温退火(65℃)，引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口，引物与靶序列完全互补，DNA连接酶即可连接封闭这一缺口，那么LCR反响的三步骤(变性-退火-连接)就能反复进行，否那么空间结构发生变化，连接反响不能进行。应用：点突变、微生物病原体、单碱基遗传病，微生物的种型鉴定等研究。〔ligaseChainReaction,LCR〕整理课件单链构象多态性检测是一种基于单链DNA构象差异检测点突变的方法。单链DNA片段呈复杂的空间构象，主要是由其内部碱基相互作用力维持的，当某个碱基发生改变时，其空间构象发生改变，相同长度的单链DNA形成的构象不同，由此形成单链构象多态性，在非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中受排阻大小不同，可以将构象上有差异的分子别离开。〔五〕单链构象多态性〔SingleStrandConformationPolymorphism,SSCP〕整理课件SSCP示意图整理课件

限制性内切酶可特异识别DNA碱基序列并对其进行切割，当基因组中的核苷酸发生突变时可造成限制酶切位点的改变，用限制酶切割基因所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，称之为限制性片段长度多态性。能导致限制性片段发生改变的酶切位点又称为多态性位点。〔六〕限制性片段长度多态性分析〔RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP〕整理课件RLFP分析法整理课件整理课件是指在基因组上单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,包括置换、颠换、缺失和插入。是人类可遗传的变异中最常见的一种，在人群中的发生率大于1%。1.密度高2.具有疾病关联性3.遗传稳定性4.检测手段易实现自动化〔七〕单核苷酸多态性〔SingleNucleotidePolymorphism，SNP〕特点：整理课件指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物外表，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息〔基因序列及表达的信息〕由于在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术如显微光蚀刻、显微打印等，且常用硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片技术

〔八〕基因芯片技术整理课件基因芯片整理课件1.优生优育与遗传性疾病2.对疾病做出诊断3.器官、组织移植的配型4.病原体诊断5.环境对人体影响检测6.法医学方面的鉴定应用范围：通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。整理课件1.遗传性疾病的基因诊断2.感染性疾病的基因诊断3.肿瘤的基因诊断4.法医学中的应用六、基因诊断在临床医学中的应用整理课件第二节流式细胞术及临床应用整理课件FALSSensorLaser一、流式细胞仪的根本介绍利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。整理课件集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞仪〔FlowCytometer)整理课件单细胞悬液或生物颗粒

分析速度高多参数精度高当代最先进的细胞定量分析技术可分选流式细胞仪特点整理课件液流系统

流动室

液流驱动系统光学系统

激光光源 光收集系统电子系统 光电转换 数据处理系统细胞分选系统二、流式细胞仪的根本构造整理课件信号产生-散射光信号当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射与激光束方向同轴的称前向角散射光信号〔FSC〕与激光束垂直的称为侧向角散色光信号〔SSC〕整理课件FSC，前向角散射光，代表细胞大小SSC，侧向角散射光，代表细胞粒度RightAngleLightDetector

CellComplexityForwardLightDetector

CellSurfaceAreaIncidentLightSource整理课件信号产生-荧光信号当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大局部以光的形式释放。整理课件单参数直方图双参数图

二维散点图等高线图和密度图假三维图三维图三、流式细胞仪数据显示方式整理课件X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“道数〞表示，根据选择放大器类型不同，可以是线性标度或对数标度Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率单参数直方图整理课件

细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。双参数数据显示整理课件纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,在图中每一个点代表一个细胞二位散点图整理课件用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相同，不同的等高线上细胞数不同。二位等高线图和密度图整理课件利用计算机技术对二维等高线图的之中视觉直观的表现方法，纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。假三维图整理课件三维图任意选择三个参数为X、Y、Z轴构成的图像，三维坐标匀为参数〔散射光或荧光〕而非细胞数。整理课件流式细胞仪检测范围细胞大小细胞粒度细胞外表面积DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原〔细胞外表/胞浆/核〕细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能凡细胞内能进行荧光标记的成分或变化都可用流式细胞仪进行检测四、流式细胞仪的应用整理课件DNA分析0200

4006008001000G0G1sG2MDNA含量细胞数量2N4N1.细胞周期检测整理课件SubG1发生凋亡的细胞由于核内DNA裂解成许多小片段，在乙醇固定过程中小分子DNA片段穿过胞膜丧失，造成凋亡细胞内DNA含量减少，出现一个DNA含量小于2n的亚〞G1〞峰。2.细胞凋亡分析整理课件3.细胞增值的检测与分析CFSE单参数法CFDA-SE〔羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯〕是一种非极性分子，进入细胞后可以被分解成CFSE，不可逆地和细胞内蛋白的Lysine残基或其它氨基结合。被CFDA

-SE标记的非分裂细胞的荧光非常稳定，稳定标记的时间可达数个月。当细胞分裂时。CFSE标记物平均分配到两个子代细胞，因此其荧光强度是亲代的一半。整理课件图中细胞被标记并刺激后，可跟踪细胞的分裂。配合使用Modfit软件分析，可确定每代的细胞数。细胞增殖的检测与分析整理课件4.细胞相对大小和颗粒性分析整理课件5.细胞活性分析FluoresceinDiacetate〔二乙酸荧光素〕进入活细胞后,被胞内酯酶降解，生成荧光底物.活细胞会发绿色荧光整理课件GranulocytesMonocytesEosinophilsBasophilsNeutrophilsLymphocytesTBNKTHelperTCytotoxicPeripheralWhiteBloodC