太子参总皂苷的含量测定方法研究

沈阳药科大学成人高等教育毕业论文太子参总皂苷的含量测定方法研究学生姓名：专业形式层次：学号（或准考证号）：指导教师：实习单位：完成时间：通讯地址：邮政编码：联系电话（手机）：本人郑重声明：所呈交的毕业论文，是本人在指导老师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，成果不存在知识产权争议，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。毕业论文作者签名：引言太子参（Princens）,别名又叫孩儿参、童参、双批七、四叶参或米参，其入药部分为石竹科植物孩儿参的干燥块根，在很久之前百姓就把它当做滋补的食材和药材。根据我国传统中医书籍记载，太子参味甘，微苦，性平，归经脾，肺，具有类似人参益气健脾、生津润肺的功效。虽然药效不强，但不失为清补良品，主治脾胃虚弱、食欲不振、自汗气短、心悸失眠、病后虚弱、肺燥干咳等。人参和西洋参、太子参作为药用和食用健康营养的饮食习惯在我国部分地区（如闽东）从古代一直延续到现在。太子参主要化学成分含有太子参皂苷、棕榈酸、亚油酸、谷甾醇等，还含有糖、磷脂、氨基酸、挥发油及微量元素锰、铁、铜、锌等.近几年，越来越多的人发现太子参的作用，相应的保健产品也越来越多，如复方太子参口服液、太子参胶囊、太子参止咳平喘精（散）、太子宝、真空膨化太子参系列产品，甚至将提取太子参的液体加入到化妆品中。以往对太子参活性成分的研究多集中于多糖类物质，其生理活性研究基本为零。现有关研究证实，太子参的活性药效成分——太子参皂苷，对于调节机体代谢、抗氧化、抗自由基、抗疲劳，镇咳及抗菌抗病毒具有一定功效，增强机体免疫力。为了进一步研究太子参皂苷的生理活性，开发太子参，太子参总皂苷的测定方法的简便快速、准确、可靠具有关键意义。第1章材料与方法1.1材料1.1.1试药太子参药材粉末1.1.2仪器与试剂FA2004型分析天平（上海良平仪器仪表有限公司）；恒温水域锅（金坛市大地自动化仪器厂）；SHZ-95B型循环水压式多用真空泵（上海予正仪器设备有限公司）；SG8200HPT超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；SZ-93A自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；GZX-9146MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；722S可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。人参皂苷Rb1（中国食品药品检定研究院）；无水乙醇（AR,重庆川东化工集团有限公司）；浓硫酸（AR,重庆川东化工集团有限公司）；香草醛（AR,天津市科密欧化学试剂开发中心）；高氯酸（AR,成都金山化学试剂有限公司）；冰乙酸（AR,天津市永大化学试剂有限公司）；甲醇（AR,重庆川东化工集团有限公司）；正丁醇（AR,成都金山化学试剂有限公司）；双蒸水（自制）。1.2方法表2显色系统考察结果Tab.2Resultsofcolorconditionsinspection测试液显色系统初始60min改变率编号吸光度吸光度（%）①0.0320.0332.15太子参②0.1560.1602.55供试液③0.1960.21710.73④0.1730.15113.06⑤0.1580.13812.46①0.0510.0536.68人参皂苷②0.3100.3051.61对照液③0.3450.3323.56④0.2550.2299.94⑤0.2470.2277.931.2.1供试液制备单因素根据文献中的方法，运用超声波半微量提取快速测定法H来测定人参皂苷，在具塞锥形瓶中加入过药典5号筛的太子参药材粉末0.1g，同时注入溶剂25mL，40min超声（功率500W,频率50Hz）后抽滤，取续滤液5mL到蒸发皿中，进行水浴蒸干，用甲醇溶解于10mL容量瓶中，供试液制作完成。在10mL具塞试管中加入2mL的供养液，沸水浴挥去溶剂，并加入0.2mL5%的香草醛-冰醋酸溶液（需临时配制）与0.8mL高氯酸混匀，密塞，置60°C水浴中加热20min，用冷水冷却后，加入冰醋酸5mL摇匀。另取相同体积甲醇设定为空白对照，在560nm波长下测定吸光度。（1） 提取溶剂的选取。挑选甲醇、无水乙醇、水饱和的正丁醇三种液体为提取溶剂来制备太子参供试液，所测定的总皂苷含量分别为2.72%、0.66%和14%。由于不同的提取溶剂制备的供试液中存在的杂质不同，结合相关文献报道，太子参中所含的皂苷总量不超过1.0%H，所以无水乙醇作为溶剂制得的皂苷供试液中杂质最少，本实验用无水乙醇为提取溶剂最佳。（2） 料液比的选取。称0.1g药典5号筛的太子参药材粉末到具塞锥形瓶中，分别加入无水乙醇溶液10、15、20、25mL，超声提取总皂苷含量分别为0.62%、0.73%、0.71%、0.66%。测试结果表明皂苷含量与加入的溶剂量非正比例关系，溶剂量达到一定值后，皂苷含量反而减少。0.1g药材与15mL无水乙醇混匀所制得的供试液中总皂苷含量最高，所以本实验以15mL无水乙醇制备供试液为最佳。（3） 药材粒度的筛选。称取0.1g的过药典3、5、6、7、8号样品药材于五个不同容器中,同时加入15mL相同的无水乙醇溶液，超声提取后测定总皂苷含量分别为0.48%、0.73%、0.74%、0.75%、0.74%。过药典8号筛与过药典6号筛所测定的结果相同，而过药典7号筛时所测得的皂苷含量最高，这可能因为过药典8号的药材粒度过小，少量药渣堵塞滤纸，导致结果偏低。所以本实验用过药典7号筛的药粉进行测定为最佳。（4） 提取时间的选取。称取相同药材粉末0.1g（最佳为过药典7号筛）加入15mL无水乙醇后，分别超声提取20、30、40、60、90、120、150min,测定总皂苷含量分别为0.45%、0.65%、0.75%、0.76%、.78%、.79%、0.73%。从实验结果可以看出，在120min时皂苷含量测定值最高。在120min前皂苷含量与提取时间成正比。在150min时，皂苷含量明显降低，可能是由于时间过长后，溶剂升温，部分待测成分结构因为温度而改变，使结果大幅度降低了。在90min与120min时皂苷含量相差不大，考虑到成本、工作效率等因素，本实验选提取90min来测定为最佳。1.2.2供试液制备称0.1g太子参药材粉末（过药典7号筛）于容器，加15mL无水乙醇溶解,超声提取90min,过滤取续滤液5mL于蒸发皿中，水浴蒸干，在甲醇中溶解并定容于10mL容量瓶中，作为备用的供试液。1.2.3供试液显色系统选取由于太子参总皂苷测定中没有从太子参中分离得到的对照物，所以，选取化学结构相似的人参皂苷Rb1作为对照来考察了供试液显色系统。取2mL太子参供试液到具塞试管中，水浴挥干后，于560nm处分别按下列显色系统进行吸光度的测定；同时称10.76mg人参皂苷Rb1用甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，混合均匀后取0.2mL于具塞试管中，水浴挥干后也分别按下列显色系统进行显色反应：（1）加入5mL高氯酸,放置在25°C水浴中保温20min,取出后冷却至室温后进行测定0。（2）加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液，混匀后，加入5mL60%硫酸溶液,混合均匀后放置在60C水浴中保温20min,取出后马上用冷水冷却后测定6。（3）加入0.2mL8%香草醛-乙醇溶液，混匀后，加入5mL60%硫酸溶液，再次混合均匀，放置在60C水浴中保温20min,取出后马上用冷水冷却后测定63。（4）加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液，混匀后，加入0.8mL高氯酸，再次混合均匀，放置在60C水浴中保温20min，取出后马上用冷水冷却，再加入冰醋酸溶液5mL，摇匀后进行测定67。（5）称0.1g香草醛放置于10mL的容量瓶中，依次加入冰醋酸2mL和高氯酸8mL，配置成5%的香草醛-冰醋酸和高氯酸以1：4比例混合的混合液。取1mL混合液于具塞试管中摇匀，放置在60C水浴中保温20min,取出后用冷水冷却，再加入冰醋酸溶液5mL，摇匀后进行吸光度的测定68。每种显色系统分别用太子参皂苷供试液和人参皂苷Rb1标准液（0.45mg/mL,每次0.2mL参与反应）同步测定初始吸光度（、_）和60min时的吸光度（A60_），并计算吸光度的改变率。全面考虑显色系统的敏感性和稳定性，选取最佳显色系统。1.2.4供试液制备正交设计优化通过单个因素分别考察试验可以发现，一旦提取溶剂确定后，对总皂苷含量影响较大一般是药材粒度、料液比和提取时间，所以，围绕这3个影响因素设计了L9（34）3因素3水平的正交试验（表1）。

表1正交试验方案Tab.1Thefactorsandlevelsoforthogonaltest因子水平药材粒度A溶剂用量B（mL）提取时间C（min）1过6号筛10902过7号筛151053过8号筛201201.2.5方法学考察（1） 线性关系考察。制备对照品溶液：称取4.5mg人参皂苷R^对照品,放在25mL容量瓶中，用甲醇溶解，摇匀定容，制作为标准溶液。标准曲线制备：吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mL的对照品溶液,分别放在10mL相同的具塞试管中，水浴挥干后，加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液,摇匀，再加入5mL60%硫酸溶液,混合均匀后放在60C水浴中保温20min,取出后用冷水冷却进行吸光度的测定。同时用甲醇作为空白对照，在560nm波长处进行测定，把结果整理绘制出标准曲线。横坐标为人参皂苷Rb1对照品溶液浓度（pg/mL），纵坐标为测得的吸光度。（2） 精密度试验。按照1.2制备皂苷供试液，吸取2mL供试液,按上述线性关系进行测定，从“水浴下挥干溶剂”开始测定吸光度，计算RSD值。（3） 稳定性试验。按1.2制备皂苷供试液，吸取2mL供试液,按上述线性关系进行测定，从“水浴下挥干溶剂”开始，每隔20min测定1次吸光度，计算RSD值。（4） 重复性试验。按1.2同时称取6份太子参药材，制备出太子参皂苷供试液，吸取2mL供试液,按上述线性关系进行测定，从“水浴下挥干溶剂”开始，测定吸光度并计算RSD值。（5） 加样回收率试验。称0.05g已知总皂苷含量的样品粉末（过7号筛），同时称取5份，分别加入相同质量的人参皂苷Rbi标准品0.4mg。按1.2制备皂苷供试液的方法，取2mL供试液,按上述线性关系进行测定，从“水浴下挥干溶剂”开始，测定吸光度，计算平均回收率以及RSD值。第2章结果与分析2.1显色系统筛选由于太子参总皂苷的含量不是自己本身的含量，而是用人参皂苷R^标准品标定的，所以人参皂苷R^和太子参皂苷供试液在显色系统中的敏感性及稳定性决定着选取的显色系统好坏。由试验结果可以看出（表2），显色系统②的敏感性与稳定性都相对最高，所以，用②号显色系统来测定最佳。具体为：向存在已挥干溶剂的供试液的具塞试管中加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液,摇匀，加入5mL60%硫酸溶液,混合均匀后放在60°C水浴中保温20min,取出后用冷水冷却，在光密度560nm处进行测定。2.2精密度试验按上述太子参皂苷供试液制备的方法，制备出太子参供试液，连续快速地测定5次，吸光度分别为0.155、.152、.156、.154、.154，计算得到RSD值为0.96%，表明仪器精密度良好。根据1.2项下太子参皂苷供试液制备的方法，2.3.3稳定性试验制备太子参供试液，分别测定0、20、40、60、80、100min时的吸光度，分别为0.155、0.152、.154、.156、.154、.155，计算得到RSD值为0.88%，表明该测定方法在100min内是稳定。根据1.2项下太子参皂苷供试液制备的方法，2.3.4重复性试验平行称取6份同批次太子参药材制备太子参供试液，测定皂苷含量。计算得到RSD值为1.97%（表4），表明该方法重复性良好。按1.2项下太子参皂苷供试液制备的方法，2.3.5加样回收率试验平行称取5份已知皂苷含量的同产地太子参药材，分别加入0.4mg人参皂苷制备太子参供试液，测定皂苷含量。计算RSD值为1.25%，平均回收率为98.82%（表5），表明该方法准确度良好。第3章讨论3.1太子参皂苷不仅具有增强免疫力等药理作用，其含量还在一定程度上表征太子参生长的环境变化，因此，在太子参的质量控制中，太子参的皂苷含量举足轻重。目前，由于太子参皂苷在测定中缺少自身标准品，所测得的含量多为一种模糊值，使保证太子参的质量受限。本试验得到的超声波半微量提取测定法，较其他方法具有快捷、灵敏、取样少等优点，在太子参中皂苷标准品缺少的测定研究中，具有一定的应用价值。但若想使太子参皂苷作为一个指标性成分在太子参的质量控制中得到更好的应用，还需要在太子参皂苷标准品方面深入研究。3.2超声波是一种机械波，散射衰减发生在不均匀介质中传递时，实验中超声提取时，样品整体作为一种介质在各方向上是不均匀的，到达样品内部的超声机械能量会有一定程度的衰减，从而影响提取效果H。本试验采用〇.1g的药材用量，其原因：一是可以使药材不受震动、摇晃等影响，在250mL的具塞锥形瓶中都能平铺于瓶底，堆积厚度较小，降低了超声波的衰减；二是使试剂更充分的浸提样品内部的作用；三是当使用较少药材时一定程度可忽略杂质干扰。结论在当今的社会，新的生物皂苷资源存在举足轻重的意义，为工业化生产太子参皂苷、开发相关保健食品和进一步在医学临床试验中的应用提供科学根据。至今为止，太子参总皂苷的测定方法很少，一般是在可见光区中定量测定皂苷与芳香醛高氯酸试剂产生的显色反应。本实验参考众多文献，综合考虑用不同提取方法，如：用水浸提法、正丁醇萃取法、丙酮-乙醚沉淀法、大孔吸附树脂法等方法进行太子参中的有效成分的定性测定，一旦确定含有三萜皂苷这种化合物后，采用分光光度法，以人参皂苷Re为对照品，测定太子参中总皂苷的含量，方法快速简单，重复性良好。参考文献[1]彭爱红，熊何健，颜宇航.太子参总皂苷的含量测定方法研究[J].四川师范大学学报（自然科学版），2006，06：743-746.[2]窦芳，汤海峰，奚苗苗，文爱东.11种中药总皂苷对α-葡糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用研究[J].中国药房，2013，v.24；No.43319：1732-1734.[3]张敏，王慧娟，林冰，赵致，周英.太子参总皂苷含量测定方法研究[J].山地农业生物学报，2013，v.32；No.13405：432-436.[4]林茂，郑炯，杨琳，陈娅娅，王沁，吴明开，朱国胜，阚健全.不同产地太子参中化学成分分析[J].食品科学，2012，v.33；No.42302：204-207.[5]丁春花，林培玲，曾建伟，陈丹，梁一池.太子参块根和参须中多糖及总皂苷含量的测定[J].福建中医药大学学报，2012，v.22；No.11503：40-43.[6]梁玉勇，尹双双，左北梅，高文远.太子参不定根组织培养的研究[J].中国中药杂志，2012，v.3724：3803-3807.[7]赵凯，赢飘，张欣，曹国璠.连作年限对太子参经济性状、产量