红酵母发酵类胡萝卜素的研究

红酵母发酵类胡萝卜素的研究

类胡克是一个大型的天然色素家族，总共600种。其在生物体内的作用有很多,如参与绿色植物的光合作用,动物体内合成维生素A的前体,抗氧化及减少癌症的发生和发展、减少心血管疾病发病率、增强免疫功能等独特的生理功能。其中β-胡萝卜素在生产生活当中的应用非常广泛,可以添加到饲料、食品、化妆品以及药品中,市场前景十分广阔。由于食品工业、养殖业迅速发展使生物来源的类胡萝卜素倍受关注,利用微生物生产类胡萝卜素是获得生物资源型类胡萝卜素的最重要的途径。利用红酵母发酵生产类胡萝卜素具有营养需求简单,生产周期短等优点,但目前所报道的红酵母产量均较低,所以寻找优良的菌种和培养基成为亟待解决的问题。本研究通过单因素和正交试验对比2种基础培养基,寻找红酵母的最佳生长条件,为今后进一步提高类胡萝卜素的产量奠定了试验基础。1材料和方法1.1病毒红酵母(Rhodotorulamucilaginosa):大连工业大学资源开发利用研究所分离保存。1.2生化试剂及培养基葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉、丙酮、磷酸氢二铵、尿素、氯化铵均为生化试剂和分析纯。斜面活化培养基:4%葡萄糖,1%蛋白胨,1%酵母膏,2%琼脂粉,自然pH值。种子液体培养基:2%葡萄糖,1%蛋白胨,1%酵母膏,自然pH值。液体发酵培养基:2%葡萄糖,1%蛋白胨,1%酵母膏,用5%NaOH调pH值为6。1.3测试方法1.3.1液体种子培养基种子液培养:从活化的斜面培养基中取2环红酵母菌体放入装有50mL液体种子培养基的三角瓶(250mL)中,28℃、120r/min摇床暗箱培养24h。发酵液培养:取种子液5mL置于装有50mL培养液的三角瓶(250mL)中28℃、120r/min暗箱培养3d。1.3.2类胡萝卜素浸提液的制备生物量的测定:细胞干重法,将培养后的发酵液3000r/min离心15min得红酵母菌体,75℃烘干12h至恒重称量。细胞破壁与提取方法:采用酸-热破壁法:将0.1g干菌体放入100mL三角瓶中,加入5mL3mol/L的盐酸室温浸泡1h,沸水浴3min,迅速冷却,6000r/min离心15min沉淀为细胞残渣,用丙酮定容至10mL萃取,得类胡萝卜素浸提液,如细胞碎片中仍有色素,加丙酮进一步提取,合并上清液。类胡萝卜素含量(简称色素)的测定,计算公式:式中:Aλmax为最大吸收波长475nm处的吸光度值;V为提取所用有机溶剂的总体积,mL;D为浸提液稀释倍数;W为干酵母菌体重量,g;0.16为类胡萝卜素的消光系数。1.3.3ds溶液的制备3,5二硝基水杨酸法制作葡萄糖浓度标准曲线:称取1g葡萄糖溶于100mL容量瓶,分别取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL,去离子水定溶至3mL,加1.5mLDNS溶液,沸水浴5min迅速冷却。冷却后定容至25mL,在波长540nm处测量吸光度值,标准曲线见图1。2结果与分析2.1培养基碳源和类胡萝卜素含量的确定分别取2%葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖和果糖,其他培养基成分和培养条件不变,红酵母的生物量和类胡萝卜素含量见图2。其中生物量最高为果糖,其次为蔗糖和葡萄糖,但是这3种碳源中葡萄糖培养的红酵母中类胡萝卜素含量较高,从成本和产量总体考虑选择葡萄糖和蔗糖作为候选碳源。分别取1%蛋白胨、磷酸氢二铵、尿素和氯化铵,其他培养基成分和培养条件不变,红酵母的生物量和类胡萝卜素含量见图3。从图3可以看出,蛋白胨的生物量最大,其次是磷酸氢二铵,但是磷酸氢二铵中类胡萝卜素的含量要大于蛋白胨,这是因为磷酸氢二铵对发酵液具有缓冲作用,并且含有磷源,对红酵母合成类胡萝卜素有促进作用,所以试验选择蛋白胨和磷酸氢二铵作为候选氮源。从图2和图3观察到,在试验条件下,生物量较小时色素含量很高,这是因为类胡萝卜素是一种从TCA循环得到的中间产物进一步合成的次级代谢产物,主要在稳定期合成积累。当培养基中添加乳糖和尿素时,红酵母较快进入稳定期,类胡萝卜素含量得到一段时间积累,含量较高。综合考虑,选择2组基础培养基,葡萄糖组:葡萄糖+蛋白胨+酵母膏;蔗糖组:蔗糖+磷酸氢二铵+酵母膏。2.2葡萄糖组各组分的加入量确定2.2.1葡萄糖添加量对红酵母胞内色素含量和产量的影响保持蛋白胨和酵母膏含量不变,考察葡萄糖的添加量,结果见图4。当葡萄糖添加量为1%时,由于浓度过小,使红酵母较早进入稳定期,所以色素含量较大,但是当浓度>3%时生物量与色素产量都有所下降,选择葡萄糖添加量为3%,此时的生物量、胞内色素含量和产量分别为9.92g/L、120.00μg/g、1.19mg/L。2.2.2产量和产量保持葡萄糖和酵母膏含量不变,考察蛋白胨的添加量,结果见图5。蛋白胨添加量为1.5%时细胞内的色素含量最大,产量也最大。当添加量为2.0%时生物量最大,说明在此添加量时细胞仍未进入到稳定期,更加适合红酵母细胞生长,并且可以通过培养条件的优化,得到类胡萝卜素含量的积累,所以选择2.0%作为蛋白胨的最佳添加量,此条件时的生物量、胞内色素含量和产量分别为10.54g/L、118.13μg/g、1.25mg/L。2.2.3培养基营养补充剂酵母膏中富含蛋白质、氨基酸、多肽、核苷酸、B族维生素等微量元素的一种氮源,研究将其作为培养基的营养补充剂添加。考察酵母膏的添加量对红酵母发酵的影响见图6。酵母膏添加量为1.5%时,生物量和类胡萝卜素产量最大,所以选择酵母膏的最佳添加量为1.5%,此条件时的生物量、胞内色素含量和产量分别为11.38g/L、120.63μg/g、1.37mg/L。2.3最佳教育条件的确定培养条件的确定以上述最适培养基组分配比为前提,寻找红最适合类胡萝卜素生成和积累的培养条件。2.3.1初始ph值对红酵母生长和产量的影响初始pH值对红酵母发酵的影响见图7。由图7可见,红酵母可以再初始pH值为5~8时均可较好生长,当初始pH值为6时类胡萝卜素的含量和产量都较大,所以选择初始pH值为6。2.3.2红酵母细胞代谢温度对红酵母发酵的影响结果(图8)可见,30℃是类胡萝卜素的最适积累温度,这是由于红酵母细胞内参与代谢的酶最适温度不一致。在此温度条件下初级代谢相对较弱,使得合成类胡萝卜素的次级代谢前体物质较多,导致红酵母细胞内的色素合成数量增加,30℃应该是红酵母代谢类异戊二烯途径中所需酶的最佳反应温度,所以选择30℃为最适培养温度。2.3.3类胡萝卜素的合成摇床转速对红酵母发酵的影响见图9。一般情况下,摇床转速越高,培养基中的溶解氧越多。当摇床转速达为180r/min时,生物量有小幅度增加,但是类胡萝卜素的含量开始下降,因为溶解氧比较多,红酵母的TCA循环比较旺盛,初级代谢较强,菌体生物量较大,导致合成类胡萝卜素的中间产物较少,所以类胡萝卜素的合成比较少。最佳摇床转速选择160r/min。2.3.4物质积累的特点以上述单因素试验确定的最佳条件考察红酵母菌体生长及类胡萝卜素积累。从图10可以看出,红酵母发酵在120h后进入稳定期,在最后培养的48h内生物量仅增加了0.36g/L。类胡萝卜素符合次级代谢产物积累的特点,168h的培养时间内一直在增加,稳定期时积累速度加快,168h时色素含量最大,为176.6μg/g,产量为2.54mg/L。通过对发酵液pH值和残糖测量结果(表1)可以看出,红酵母发酵可以分为2个阶段:第1阶段为从开始到96h时,微生物主要利用发酵液中的葡萄糖,通过糖酵解途径和柠檬酸循环进行初级代谢,分泌代谢出有机酸,使发酵液pH值呈下降趋势;当发酵液中葡萄糖含量不足时红酵母进入到过渡期,红酵母细胞一方面利用葡萄糖,一方面利用代谢出的有机酸,令发酵液中葡萄糖含量进一步下降,pH值升高,发酵进入到第2阶段;稳定期的葡萄糖含量和发酵液pH值也比较稳定。2.4培养基配比试验以葡萄糖组添加量为参考,设计正交试验的各因素及其浓度水平见表2,结果见表3,方差分析见表4。从表3与成本方面考虑,第8组试验为最佳培养基配比,即蔗糖4%,磷酸氢二铵1.5%,酵母膏1%,培养168h。最大产量为2.53mg/L,与葡萄糖组培养168h的最大产量2.54mg/L相似。从表4可以看出,蔗糖添加量对红酵母发酵产类胡萝卜素影响显著,这是因为培养基中的蔗糖不仅可以为红酵母生长提供能量,并且是其合成类胡萝卜素时碳元素的来源。3红酵母发酵过程中残糖和总ph值的变化试验选择2组适合红酵母发酵的培养基组分,分别研究其添加量对红酵母发酵生产类胡萝卜素的影响,通过生物量选择培养基,色素含量选择培养条件以得到红酵母的最大产量,得出以下结论:(1)葡萄糖组最佳添加量为3%葡萄糖,2.0%蛋白胨,1.5%酵母膏,此时的生物量、色素含量和产量分别为11.38g/L、120.63μg/g、1.37mg/L。(2)红酵母产色素的最佳培养条件为pH值为6,温度30℃,摇床转速160r/min,培养时间168h,此时的生物量、色素含量和产量分别为14.38g/L、176.6μg/g、2.54mg/L。(3)在红酵母发酵过程中分析了残糖以及pH值随时间的变化,发现红酵