应用双启动寡核苷酸引物技术建立检测蚊媒病毒的多重r-pcr方法

应用双启动寡核苷酸引物技术建立检测蚊媒病毒的多重r-pcr方法

动物疾病是由吸血动物和动物抓伤的病毒。其中100多种可能导致人类疾病，而且严重病例会导致死亡。本研究中日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus,JEV)、黄热病毒(YellowFeverVirus,YFV)、西尼罗病毒(WestNileVirus,WNV)、圣路易斯脑炎病毒(St.LouisEncephalitisVirus,SLEV)和登革病毒(Denguevirus,DV)均属于蚊媒病毒,主要由库蚊和伊蚊传播。目前我国除JEV和DV外,其他3种病毒尚未出现,但是库蚊和伊蚊在我国分布广泛,为其传入提供了方便。因而,同时迅速、准确地对蚊媒病毒的感染和混合感染做出检测具有重要意义。多重RT-PCR技术对于混合性感染的疾病,特别是具有相似临床症状和流行病学特征的病原体的诊断方面意义很大,可以降低实验成本,提高实验效率。近年来,一种基于双启动寡核苷酸引物(dualprimingoligonucleotide,DPO)的多重RT-PCR技术开始兴起,既可保证扩增的特异性,又可大大提高扩增效率,为多重PCR技术的应用提供了新的前景。本研究应用DPO引物技术初步建立了检测JEV、YFV、WNV、SLEV和DV5种蚊媒病毒的多重RT-PCR方法,为检测蚊子所携带的一种或多种病毒提供了迅速、准确而可靠的诊断方法。1材料和方法1.1材料表面1.1.1材料和质粒日本脑炎病毒SA-14-14-2疫苗株来自武汉生物制品研究所、黄热病毒减毒活疫苗来自北京天坛生物制品公司,pcD-NA5-WNV-JMEW-RNA(NY99-eqhs株)、pcD-NA5-SLEV-JMEH-RNA(Hubbard株)质粒和pMD19-DV质粒由本实验室保存。1.1.2pcr检测dnaTaq酶及PCR缓冲液(Takara,大连)、DNA-marker(Takara,大连)、RNA提取试剂盒(QIAGEN,Germany)、逆转录试剂盒(PROMEGA,USA)。1.1.3改进病毒引物的设计和合成通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)查询已发表的JEV、YFV、WNV、DV和SLEV毒株的全基因序列,利用DNAStar软件分别比对5种病毒代表株的基因序列,找到病毒的序列保守区。在5种病毒的保守区域,依照DPO引物的设计原则,利用PrimerPremier5.0软件分别设计针对五种病毒的DPO引物并由上海生工生物技术有限公司合成。引物设计目标基因及预期扩增产物大小见表1。1.2方法1.2.1算考贝数质粒pcDNA5-SLEV-JMEH和pcDNA5-WNV-JMEW质粒按体外转录试剂盒说明书进行体外转录,测定RNA浓度,计算拷贝数分别为2.6×1012copies/μl和2.3×1012copies/μl;根据武汉生物制品研究所及北京天坛生物制品公司提供的JEV和YFV病毒液的数据,经公式计算,JEV的滴度为5.0×106PFU/ml;YFV的滴度为4.5×105PFU/ml;以DV-1型病毒为模板,制备DV质粒,测定DV质粒浓度为48.2ng/μl,经计算DV质粒DNA的拷贝数为1.37×1010/μl。1.2.2rt-pcr扩增条件的优化通过用单一引物检测5种病毒的混合模板和混合引物检测单一病毒模板来验证引物的特异性,按常规PCR引物浓度等量混合五对引物以及5种病毒反转录后的cD-NA等量混合作为混合模板进行RT-PCR扩增反应。1.2.3多重RT-PCR体系最佳反应条件的优化分别选择5种病毒的一个适当稀释度作为模板,等量混合,5种引物等量混合,RT-PCR反应条件和体系与单重RT-PCR反应相同。根据电泳结果,主要对引物浓度、Mg2+浓度和退火温度进行优化。1.2.4rt-pcr检测取20μlJEV和YFV的病毒液10倍系列稀释,稀释度为10-1~10-6,分别取140μl用试剂盒提取RNA后RT-PCR检测;取1μlpcDNA5-SLEV-JMEH-RNA和pcDNA5-WNV-JMEW-RNA体外转录后的RNA10倍系列稀释,稀释度为10-1~10-10,然后每个稀释度分别取2μl作为模板直接RT-PCR检测;取1μlpMD19-T-DV质粒DNA10倍系列稀释,稀释度为10-1~10-9,由于体外转录的RNA模板和质粒模板的DNA浓度较高,所以从10-4开始检测;多重RT-PCR反应敏感性的测定在单重RT-PCR反应敏感性基础上进行,并依次降低一个数量级进行筛选。1.2.5wnv-prm、sclev-cprm质粒的提取分别取50只埃及伊蚊、三带喙库蚊和白蚊伊蚊加Trizol试剂制成匀浆,然后与WNV-prM、SLEV-CprM质粒RNA、DV质粒、JEV和YFV细胞培养液混合,静置10min,短暂离心(8000g30s),取上清,直接提取RNA,然后进行多重-RT-PCR检测。2结果2.1r-pcr反应扩增的特定试验2.1.1扩增有效蛋白每种病毒的单一引物(终浓度为0.4μmol/L)只能扩增出相应病毒模板的目的条带,与其他4种病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性(图1)。2.1.2混合索引检测独特的病毒模型2.2引物浓度和其他指标的浓度经过优化,确定最终反应条件:引物浓度:SLEV、YFV和WNV的引物浓度为0.4μmol/L,DV和JEV的引物浓度为0.8μmol/L;Mg2+浓度:1.5mmol/L;dNTP浓度:250μmol/L;退火温度:50.0℃(图3)。2.3抗凝剂灵敏度和rt-pcr检测限的比较分别取10μlJEV、YFV、pcDNA5-SLEV-JMEH-RNA、pcDNA5-WNV-JMEW-RNA及pMD19-T-DV单重扩增反应后的产物,经1.5%的琼脂糖凝胶电泳,依次最低能检测到10-4、10-3、10-9、10-8和10-7稀释度的相应病毒液,即灵敏度分别为500PFU/ml、450PFU/ml、2.3×104copies/μl、2.6×103copies/μl和1.37×103copies/μl,而五重DPO-RT-PCR反应JEV、YFV、SLEV、WNV和DV的检测限均比单一病毒RT-PCR反应低一个数量级即灵敏度分别为5000PFU/ml、4500PFU/ml、2.3×105copies/μl、2.6×104copies/μl和1.37×104copies/μl,电泳结果见图4~6。2.4蚊的pcr检测在3种不同种类的蚊RNA中添加阳性样本,以阴性蚊的样本作为对照,利用优化好的多重PCR方法检测蚊样本。结果表明(图7),阴性对照成立,3个样本中的5种病毒均可检出,且无非特异扩增反应。3po引物技术检测本实验针对JEV、YFV、WNV、SLEV及DV5种蚊媒病毒的同时检测方法进行研究。其中,YFV、WNV及SLEV在我国尚未发现,但随着旅游业和国际贸易的发展,这几种病毒传入我国的可能性显著增加。所以,在我国针对这几种病毒的检测研究,具有重要的意义。目前,国内外学者已经建立了利用RT-PCR检测这几种蚊媒病毒的方法,但是利用多重RT-PCR技术同时检测多种蚊媒病毒国内外报道很少。主要是因为在传统的多重RT-PCR体系中,引物二聚体的形成以及引物与模板之间的错配严重制约着多重RT-PCR的应用。DPO引物技术是近几年发展起来的一种新的技术,研究主要集中在检测病毒的复合感染等。LeeCS等在检测临床样本中的猪流感病毒H1、H3、N1、N2不同亚型时,运用一步RT-PCR的方法与DPO引物技术相结合,取得了预期的结果。DPO引物是指将普通的引物分为2个独立的部分:一部分是5’端,另一部分是3’端,5’端的碱基数要比3’端的碱基数多,即5’端的长度要长于3’端,而两部分之间是有多聚次黄嘌呤(polyI)碱基连接的。由于次黄嘌呤碱基(I碱基)的氢键结合力较弱,所以相比较于其他碱基,I碱基的解链温度低。DPO引物引导PCR扩增时,无论3’端或是5’端发生2个碱基以上的错配,PCR扩增就不会继续。因此,只有模板与特异性引物5’端和3’端均匹配时,PCR扩增才能进行,这样就可以有效地阻断非特异扩增,提高扩增效率。本研究在单个病毒RT-PCR的灵敏度检测中,JEV与YFV的灵敏度分别为500PFU/ml和450PFU/ml与国内外报道基本一致,WNV与SLEV质粒RNA拷贝数检测限分别为2.3×104copies/μl和2.6×103copies/μl,而DV质粒拷贝数的检测限也在1.37×103copies/μl,把拷贝数换算成PFU与JEV与YFV的灵敏度比较在同一水平。在蚊模拟添加实验中,利用所建立