黄连碱对l-名字致高血压大鼠胸主动脉舒缩功能的影响

黄连碱对l-名字致高血压大鼠胸主动脉舒缩功能的影响

中药黄连是黄连科植物的干燥根茎。它是传统医学中使用的一种长期清热解毒药物，具有清热、除湿、解毒、清火的功效。现代研究表明,黄连具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病等作用。黄连中含有大量活性化合物,包括小檗碱、黄连碱、表小檗碱等多种异喹啉生物碱类化合物。有文献报道,黄连碱可以通过将血管平滑肌细胞阻滞在G1期而发挥抗细胞增殖作用;但其对高血压动物血管功能的研究尚未有报道。为了探讨黄连碱对血压以及血管功能的影响,本研究利用NO合酶抑制剂N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)诱导的大鼠高血压模型,考察黄连碱对高血压大鼠的降压作用及其对L-NAME诱导高血压大鼠血管功能的影响。1材料和方法1.1化学试剂和仪器L-NAME、去甲肾上腺素(NE)、乙酰胆碱(ACh)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、二丁酸佛波醇酯(PDBu)等购自美国Sigma公司;硝普钠(SNP)购自北京化学试剂公司;黄连碱由中国医学科学院药物研究所秦海林老师课题组提供。BP-98A小动物无创尾压测定仪购自日本Softron公司;BL-420S生物机能实验系统购自成都泰盟科技有限公司。其余试剂均为市售分析纯。1.2实验动物SPF级120～140gWistar♂鼠,购自北京维通利华实验动物有限公司[合格证编号SCXK(京)2006-0009]。1.3动物分组及给药方案取大鼠79只,随机抽取15只作为正常对照组,其余作为高血压模型组。模型组大鼠按每只每天40mg·kg-1灌胃L-NAME,正常组每天给予同等剂量蒸馏水。到L-NAME造模第3周时,测定大鼠尾动脉血压,选择SBP大于18.67kPa的动物(共54只)作为造模成功的高血压大鼠进行后续研究。动物分组:除正常组外,模型动物随机分为模型组(15只)、黄连碱低剂量组(12只)、黄连碱中剂量组(14只)、黄连碱高剂量组(13只)。黄连碱低、中、高剂量组大鼠每只每天分别灌胃给予黄连碱10、30、100mg·kg-1;连续给药6周,期间每周测定一次给药干预1h后的血压和心率。此外,除正常对照组给予同等剂量的生理盐水外,其余各组大鼠每只每天继续给予40mg·kg-1的L-NAME。1.4kh液冲洗及血管张力检测大鼠断头处死后,迅速分离胸主动脉并小心清除周围脂肪及结缔组织,剪取2段长约3mm的血管环,悬挂于内盛10mlK-H液(mmol·L-1:NaCl120,KCl4.7,KH2PO41.2,NaHCO325,glucose11.1,CaCl22.5,MgSO41.2)、37℃恒温的浴槽中,充以95%O2和5%CO2的混合气体。调节血管环的初始张力至1.2g,平衡1h,期间每隔20min用预温至37℃的K-H液换液1次。随后给予两次80mmol·L-1KCl刺激,记录KCl引起的最大收缩值。用K-H液冲洗至血管张力回到基线后进行下一步实验。给予一段血管环累积浓度的NE(10-9～10-5mol·L-1,浴槽内的终浓度,以下均同)刺激,观察血管对NE的收缩反应性。用KH液冲洗数次后,平衡20min,向浴槽中加入NE(10-6mol·L-1)使血管收缩达到平台后再加入10-10～10-5mol·L-1的ACh,观察血管依赖内皮的舒张反应。用KH液冲洗后,换成无钙KH液平衡20min(中间每隔5min换一次新鲜无钙KH液),加入NE(10-6mol·L-1),随后再加入80mmol·L-1的KCl以及0.1～2.5mmol·L-1的CaCl2。给予另一段血管环累积浓度的KCl(10～80mmol·L-1)刺激,观察血管对高钾的收缩反应性。用KH液冲洗至血管张力回到基线后加入AngⅡ(10-7mol·L-1);冲洗后平衡20min,加入NE(10-6mol·L-1)预收缩血管后再加入10-10～10-5mol·L-1的SNP,观察不依赖内皮的血管舒张反应。用KH液冲洗两次,平衡20min后再加入PKC激动剂PDBu(10-7mol·L-1)。1.5ach和snp的扩张反应,为ach、snp的表达提供了依据血管收缩反应性以绝对张力值与高钾(80mmol·L-1)刺激引发的最大收缩张力值的百分比表示;血管对ACh和SNP的舒张反应以胸主动脉舒张张力值占10-6mol·L-1NE引起收缩张力值的百分比表示。实验数据采用SPSS13.0软件进行统计学处理,数据以x¯±sx¯±s表示,组间比较采用One-wayANOVA检验。2结果2.1对大鼠sbp、心率的影响给药前,模型组与黄连碱低、中、高3个剂量组的SBP分别为(20.13±0.40)kPa、(20.80±0.53)kPa、(20.53±0.40)kPa、(20.53±0.40)kPa,均明显高于正常组的(16.00±0.4)kPa,表明给予L-NAME3周的大鼠已形成高血压状态,造模成功。给予黄连碱后,大鼠SBP并无下降趋势,仍然继续上升。此外,L-NAME造模可明显降低大鼠的心率,同正常组比差异有统计学意义(P<0.05);而黄连碱没有逆转L-NAME导致的心率降低,表明其对L-NAME导致高血压大鼠的心率影响不大。结果见Fig1。2.2黄连碱对l-特罗大鼠胸动脉收缩功能的影响2.2.1比例比较由Fig2可知,模型组大鼠血管平滑肌细胞内钙释放引发的收缩反应低于正常组大鼠(15.69±1.11)%vs(17.87±2.34)%;而黄连碱各剂量组的大鼠血管平滑肌对细胞内钙释放引起的收缩反应均比模型组增强,低、中、高3个剂量组的收缩值分别为(23.03±2.83)%、(22.22±2.11)%、(18.13±1.25)%,其中低、中剂量组同模型组比差异有显著性(P<0.05)。2.2.2不同的血管对细胞外钙内流引起的收缩反应的影响3为大鼠胸主动脉对细胞外钙内流引起的收缩反应结果。由图可知,与正常组相比,模型组大鼠的血管对细胞外钙内流引起的收缩反应有降低的趋势。低剂量的黄连碱能轻微升高外钙内流的收缩反应性;而黄连碱中、高剂量组同模型组和正常组相比则表现出降低外钙内流引起的收缩反应的趋势,尤其是在钙离子高浓度下黄连碱高剂量组同模型组比可降低这种反应性(P<0.05)。2.2.3各组患者的收缩反应比较L-NAME诱导高血压大鼠的胸主动脉对NE和KCl引起的收缩反应同正常组比均有降低,尤其在NE高浓度下同正常组比较差异有显著性(P<0.05)。但黄连碱3个剂量组大鼠的胸主动脉对NE和KCl的反应性没有改善的趋势。2.2.4不同剂量化学成分对大鼠ang的反应性影响模型组大鼠的胸主动脉对AngⅡ的反应性与正常组相比有降低的趋势(7.22±1.21)%vs(10.26±1.47)%。黄连碱各剂量组的胸主动脉对AngⅡ反应性同模型组比有增加的趋势,并呈一定的剂量依赖性。此外,L-NAME导致高血压大鼠的胸主动脉对PDBu的反应性同正常组比明显增强(84.28±6.95)%vs(44.81±10.72)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。黄连碱3个剂量组的血管对PDBu的收缩反应性同模型组比均有降低的趋势,但差异无显著性。2.3不同剂量化nd-pcr对b深化了l-对no合酶的抑制作用长期给予L-NAME造模后,大鼠的胸主动脉对Ach的反应性同正常组比明显降低(P<0.05),说明L-NAME抑制了NO合酶,损伤了血管内皮。黄连碱各个剂量组的胸主动脉对ACh的反应性同模型组比没有差异,表明黄连碱可能对内皮依赖的血管舒张功能没有改善作用。此外,各组别大鼠的血管对SNP的反应性没有差异。3对l-对大鼠的特殊影响血管内皮来源的NO对维持机体血压平衡具有重要作用。NO缺乏可导致一系列心血管疾病的发生,如高血压、动脉粥样硬化等。文献报道,长期给予竞争性NO合酶抑制剂L-NAME可引发动物的持续性血压升高,是一种理想的高血压动物模型。这种模型的高血压主要与血管产生的NO减少有关。本研究中,采用每天灌胃L-NAME40mg/kg/只,从第二周开始大鼠的血压就持续升高,到第3周时大部分造模动物都出现高血压状态(SBP>140mmHg),表明该模型建立是可靠的。随着造模时间的延长,模型组的血压进一步升高。给予黄连碱6周后,大鼠的血压没有降低,同模型组比无差异,说明在本实验中黄连碱可能对L-NAME诱导的高血压没有降压作用。虽然黄连碱对L-NAME诱导高血压大鼠的血压没有影响,但黄连碱可明显增强L-NAME诱导高血压大鼠血管平滑肌对细胞内钙释放引起的收缩反应,并降低外钙内流引起的血管收缩能力,对血管功能具有一定的调节作用。缺乏Ca2+的条件下给予α受体激动剂可通过肌醇三磷酸(IP3)通路刺激细胞内肌浆网中的钙离子释放,引发短暂的血管收缩。在无钙KH液中,L-NAME长期给药可以导致细胞内钙释放引起的血管收缩功能下降,但对细胞外钙内流引起的收缩反应无影响,这与文献报道一致。长期给予黄连碱后可明显增加内钙释放引发的血管收缩反应,提示黄连碱可能影响IP3-Ca2+通路。在无钙环境中,黄连碱还能明显降低血管对细胞外钙内流引起的收缩反应性。本室前期研究发现黄连碱可抑制Rho激酶活性,而Rho激酶通路主要是通过Ca2+作用来引起血管收缩反应。因而推测黄连碱可能通过抑制Ca2+内流而降低血管的收缩反应。有研究显示,L-NAME诱导高血压大鼠的胸主动脉的收缩功能受到损伤。本研究显示,模型组大鼠的血管对NE引起的收缩反应同正常组比显著降低,对其它血管收缩因子如KCl、AngⅡ等引起的收缩反应也表现出降低趋势,与文献报道相符。此外,模型组大鼠的胸主动脉对ACh引起的舒张作用几乎没有应答,说明L-NAME造模大鼠血管的内皮依赖性舒张功能也受到损伤,与前期的研究报道一致。这也进一步证实长期给予L-NAME可抑制血管内皮来源的舒张因子NO的产生,造成内皮功能障碍。内皮功能损伤是引发高血压的重要机制之一,因而L-NAME诱导的血管舒张功能损伤又可引发血管收缩功能的异常,进而导致大鼠的血压持续升高。本实验中