视网膜自主传感神经节细胞的研究进展

视网膜自主传感神经节细胞的研究进展

iprcgs的分类和功能研究20世纪末，发现脑膜中的一些神经节细胞能够独立处理光线（opn4），并具有可执行的光反应能力。这些细胞被称为独立光学显微镜神经节细胞（iprcgs）或黑视素神经节细胞（mcrcgs）。与其他类型的视网膜神经节细胞不同,ipRGCs除了能够接受来源于光感受器的信号输入,还能通过自身表达的感光色素直接对光产生反应。在视觉系统当中,ipRGCs主要参与了非成像视觉的形成,如光线引起的昼夜节律调控和瞳孔收缩反应。少数ipRGCs的轴突可以投射到外膝体等视觉相关脑区,从而参与调控成像视觉。近年来,得益于分子生物学和遗传学的快速发展,出现了许多与ipRGCs相关的转基因动物模型和标记ipRGCs细胞的方法,ipRGCs的分类和功能研究也因此取得了很多重要进展,许多关键问题已经或正在得到解决。例如,在ipRGCs中,树突分布在撤光亚层的细胞为何具有给光输入?在光感受器缺失、或者光感受器和下级神经元没有功能连接的情况下,昼夜节律和瞳孔反射的相关回路是否可以独立工作?本文将回顾ipRGCs的发现过程,对其分类、生理和功能进行概述。黑视素自主诱导下的合成光感受器根据经典的哺乳动物视觉理论,环境中的光线到达视网膜后,首先会激活光感受器中的视蛋白(opsin,一种G蛋白偶联受体),经一系列细胞内信号转导,造成光感受器的超极化,其末端神经递质释放减少。递质释放变化所包含的信息,通过光感受器的下级神经元———双极细胞,传递到神经节细胞,在此产生动作电位,将信号传递到更加高级的视觉中枢。视网膜中除了光感受器,其它类型的神经元并不表达能够感光的视蛋白,所以不具备直接对光线产生反应的能力,其光反应的产生都需要来自光感受器的信号输入。但是,Keeler1927年通过在视网膜变性小鼠(rd/rdmouse)上进行的实验发现,成年的视网膜变性小鼠光感受器完全缺失,但是仍然能够在接受光刺激时产生瞳孔收缩反应———尽管瞳孔收缩的速度比正常小鼠慢,幅度也有所减小。上世纪90年代,Foster等人发现照明变化能够影响视网膜变性小鼠的昼夜节律性等生理反应;同时,他们发现缺失光感受器的视网膜在较短波长的光照射下,11-cis-retinal仍然可以在感光色素介导下被转化为反式,说明除光感受器以外的其它类型视网膜细胞中表达了某些类型的感光色素。这些实验都显示,在缺失光感受器的情况下,小鼠依然能够感知环境中的光照信息,提示在视网膜中除了光感受器之外还存在其他类型的感光神经元。由于实验技术和条件的限制,光感受器之外的感光神经元一直没有被鉴定出来,所以上述实验结果很大程度上还是被归因于视网膜变性小鼠中可能残留了少量光感受器。1998年,Provencio实验室在非洲爪蟾的表皮感光载黑素细胞(photosensitivedermalmelanophore)中发现了一类新的感光色素,称其为黑视素(melanopsin,基因名称Opn4);利用原位杂交的方法,他们发现黑视素的mRNA在非洲爪蟾视网膜的内核层细胞中有表达。2000年,Provencio实验室再次利用原位杂交的方法,发现小鼠和灵长类动物的视网膜中存在黑视素,而且表达在内核层和神经节细胞层的非光感受器细胞中。同年,Gooley等人将大鼠视交叉上核(superachiasmaticnucleus,SCN)逆向标记与原位杂交技术结合,发现黑视素主要表达在一类投射到SCN的视网膜神经节细胞中。2002年,研究人员利用转基因小鼠和抗体染色的方法,发现在啮齿类动物的视网膜中,少数神经节细胞表达黑视素;在使用镉离子阻断突触传递(即来自光感受器的信号输入)、甚至脱离视网膜后,这类神经节细胞依然能够保持对光反应的能力,因此称这类细胞为自主感光视网膜神经节细胞(intrinsicallyphotosensitiveretinalganglioncells,ipRGCs)[6~8]。ipRGCs表达感光色素———黑视素,所以能够不依赖于光感受器而直接对光反应。作为视蛋白家族(opsins)的成员,黑视素也是一种G蛋白偶联受体,依赖11-cis-retinal吸收光子,但是其具体的感光通路目前并不清楚。在哺乳动物视网膜中,已发现黑视素有两种异构体,可能具有不同的生理性质。已有的实验指出,在培养的哺乳动物细胞系中(转染了TRPC3通道的HEK293细胞)表达黑视素,并在培养基中加入11-cis-retinal,可以有效地诱导细胞在光照条件下产生去极化反应。与光感受器不同,ipRGCs不能直接从视网膜色素上皮层获得11-cis-retinal。在不持续添加11-cis-retinal的情况下,ipRGCs可以长时间保持对光反应的能力,在体外培养的细胞系中也是如此。一个较为合理的假说是,黑视素可能与无脊椎动物的感光色素相似———有双态稳定性:在吸收光子后,11-cis-retinal并不脱离黑视素蛋白,只是转化成all-trans-retinal;当其他波长的光子照射后,自动恢复原来的状态。但是,这个假说只在头索动物(文昌鱼)的黑视素同源蛋白中得到证实,在哺乳动物方面仍然缺少直接证据,需要更加有说服力的生理学或结构生物学结果来证明。此外,有研究发现,利用携带黑视素的病毒转染其它类型的视网膜神经节细胞,可以有效地使其产生光反应,为治疗视网膜色素变性等疾病提供了一种可能的方法。不同亚型的iprrcgs的树突联系视网膜中包含了多种不同类型的神经节细胞,按照其对给光或撤光产生的兴奋性反应,可分为给光兴奋型(ON)、撤光兴奋型(OFF)和给光-撤光兴奋型(ON-OFF)。与此相似,视网膜的内网状层(innerplexiformlayer,IPL)按照给光或撤光双极细胞末端的分布,可以分为ON亚层(给光兴奋)和OFF亚层(撤光兴奋)。通常情况下,不同类型的神经节细胞(ON/OFF)的树突,分布在视网膜内网层相对应的亚层中(ON/OFF亚层),可以作为区别不同类型神经节细胞的重要依据。除了树突分层位置的不同,不同类型视网膜神经节细胞的形态也有显著差异,如胞体大小、树突野的大小、树突分支数量和密度等。按照神经节细胞树突在分层和分支形态上的不同特征,可以对其类别进行区分。利用免疫组化染色、病毒跨突触标记和黑视素基因位点直接转入报告基因,或者DNA重组酶Cre诱导报告基因表达等方法,人们系统分析了小鼠ipRGCs的类型[14~21]。到目前为止,根据其树突形态和分层的差异,小鼠的ipRGCs可以分为五个不同的亚型,分别以M1~M5表示。同时,由于不同亚型的ipRGCs在黑视素表达水平上有差异,不同品系小鼠中被标记到的亚型数量并不相同。目前常用的标记ipRGCs的小鼠模型包括:标记M1亚型ipRGCs的Opn4:tau-LacZ或者Opn4:tdTamato;标记M1、M2两个亚型的Opn4-EGFP;标记全部五个亚型且通过Cre来诱导报告基因表达的转基因小鼠Opn4Cre/+:Z/AP。与此相似,在使用黑视素的不同抗体染色时,由于抗体灵敏度和黑视素表达水平的差异,也会标记到不同亚型的ipRGCs。在小鼠上,人们通常使用黑视素N端抗体UF006,可以标记M1、M2和M3亚型的ipRGCs,其中M1亚型的染色更强;而使用黑视素C端抗体———灵敏度较低的PA1-781,仅能标记到M1亚型的ipRGCs。M1亚型的ipRGCs树突主要分布在内网层中OFF亚层的外侧边缘,在小鼠中的数量约为900个,树突野的集合能够覆盖整个视网膜;同时,大概有20%M1亚型的ipRGCs细胞体分布在视网膜的内核层当中,属于异位神经节细胞(displacedretinalganglioncells)。M2亚型的ipRGCs树突分布在内网层中ON亚层的内侧,数量与M1亚型相近,树突野的集合也能完整覆盖整个视网膜。M3亚型的ipRGCs具有双层树突,在内网层的ON亚层和OFF亚层中都有分布[16~18],其数量较少,树突集合并不能完全覆盖整个视网膜,因此有观点认为M3亚型并不是一种独立的细胞类型。早期采用黑视素基因位点转入报告基因和免疫组化染色的方法,只标记了M1~M3三个亚型的ipRGCs。直到最近使用在黑视素位点表达Cre的转基因小鼠,诱导报告基因在ipRGCs中表达,才发现了M4和M5两个亚型的ipRGCs。虽然这两个亚型的神经节细胞不能被抗体染色,但是它们都可以在阻断视网膜中的突触传递后,保持自主对光反应的能力,属于典型的ipRGCs。形态分析发现,M4和M5亚型的ipRGCs与M2亚型的树突分层情况相似,都分布在内网层中的ON亚层。但是其树突都比M2亚型更复杂:M4亚型的树突野比M2亚型的面积更大,而M5亚型树突野比M2亚型的小。利用膜片钳记录的方法,可以分析ipRGCs对光的反应特性,以及不同亚型ipRGCs的反应是否具有差异[8,14,16,17,22,23,24,25]。与光感受器的感光色素密集分布在其外段的片层结构中不同,ipRGCs表达的黑视素只能分布在细胞表面,因此其感光蛋白的密度相对较低,对光反应的强度较小,但是,ipRGCs仍然能够在近乎单个光子激发的弱光照条件下产生反应。在新生小鼠上光感受器尚未发育成熟,与神经节细胞的联系也尚未形成,ipRGCs在光照时能够产生反应,但幅度很小且延迟很长。ipRGCs在接受光照时,反应到达峰值的时程较长,光照结束后反应的持续时间也较长。在阻断突触输入后,M1~M5亚型的ipRGCs都能够在光照下直接产生兴奋性反应,其中M1亚型的光照阈值较低,其他亚型都需要较高光亮度才会有光反应,反应延迟也更长,这可能与不同亚型细胞内黑视素蛋白的含量差异相关。正常生理条件下,ipRGCs表达谷氨酸等神经递质的受体,可以接受来自视锥细胞和视杆细胞的输入,也接受来自无长突细胞的调节。在视网膜的内网层中,M1的树突分布在OFF亚层,可是生理反应却是典型的ON反应,这与经典的视网膜理论不一致。对双极细胞及其末端突触做更细致的分析,可以发现一类ON型双极细胞可能在经过OFF亚层时与ipRGCs形成突触联系,从而介导了ipRGCs的ON输入。利用病毒跨突触标记的特性,分析与ipRGCs形成突触联系的上级神经元,在小鼠的视网膜中,可以标记到Mu″ller胶质细胞和无长突细胞,证明其与ipRGCs存在突触联系。需要注意的是,由于带状突触的病毒穿过效率较低,并没有显示出与ipRGCs有突触联系的双极细胞。同时,M1亚型的ipRGCs可以同无长突细胞形成缝隙连接,而不与其他类型细胞形成缝隙连接;在早期的视网膜钙成像记录过程中,当加入缝隙连接的阻断剂时,有光反应的细胞数量明显减少。这二者的结论是一致的。此外,多巴胺能的无长突细胞还可以接受来自ipRGCs的谷氨酸受体介导的兴奋型输入;但是,两者是否具有直接联系及其联系的机制仍然没有搞清。综上所述,ipRGCs的树突依据其分层特点和形态特征,可以分成五种不同亚型。不同亚型的ipRGCs都能表达黑视素,对光照产生直接反应,并具有各自的光反应特性。不同亚型的iprtcgs的映射模式与所有感觉输入信号相同,接受ipRGCs轴突投射的脑区决定了其功能。不同亚型ipRGCs的轴突是否投射到不同的靶点而行使不同的功能?ipRGCs与其他类型的神经节细胞轴突投射的位置有什么区别?利用原位杂交、免疫组化染色、转基因小鼠表达报告基因和逆向标记等方法,ipRGCs轴突投射的靶部位也逐渐被揭示。早期发现的一类转基因小鼠模型中(Opn4:tau-LacZ),只有M1亚型的ipRGCs表达LacZ报告基因。通过对LacZ轴突终末在不同脑区的分布进行分析,发现投射比较密集的区域包括视交叉上核(SCN)、膝状体间小叶(IGL)及橄榄顶盖前核(OPN)。前两者主要负责昼夜节律的调节,后者是瞳孔反射回路的重要部分。此外,其它部分脑区中也有少数M1亚型的ipRGCs投射,如视前区(preopticarea,PO)、下丘脑视旁核下区(hypothalamicsubparaventricularzone,hSPZ)、外膝体腹侧核(ventrallateralgeniculatenucleus,vLGN)和上丘(superiorcolliculus,SC)等,一般认为这些区域大部分与非成像视觉的通路相关,只有上丘与成像视觉相关。有趣的是,小鼠视网膜中其它类型的非ipRGCs神经节细胞,90%以上投射到对侧的外膝体或者上丘。但是,M1亚型的ipRGCs在向视交叉上核投射时,同侧投射和对侧投射的比例相近;而少数投射到上丘的轴突,却大部分来自对侧视网膜。同一类型的神经节细胞,在不同脑区中同侧投射和对侧投射的比例可以有很大差异。上文提到,使用黑视素抗体UF006染色主要标记M1和M2细胞,只有数量很少的M3细胞也被标记。而Opn4:tau-LacZ小鼠只有M1细胞表达LacZ,因此在该小鼠的不同脑区进行逆标,逆标到的M2亚型ipRGCs的胞体能够被抗体染色,但不表达LacZ,从而可以获得M2亚型ipRGCs的投射区域。研究发现,M1是投射到SCN的主要亚型,而M2则是投射到OPN的主要亚型,提示M1在昼夜节律调控中、而M2在瞳孔反射中发挥更重要的作用。利用一类新型的、在黑视素位点插入Cre的转基因小鼠(Opn4Cre/+),可以诱导荧光蛋白在全部亚型的ipRGCs中表达。将这种小鼠与上文提到的M1亚型特异性表达LacZ的转基因小鼠杂交,通过比较荧光蛋白信号(M1~M5)和LacZ信号(M1),可以分析M1亚型和其他亚型ipRGCs的投射模式是否有差异。实验发现,包括SCN、IGL、PO等区域在内,两种报告基因的信号都有分布,可见这些区域接受不同亚型的ipRGCs的投射。但是,在外侧膝状体背侧(dorsallateralgeniculatenucleus,dLGN),有明显的荧光蛋白信号,而LacZ信号却几乎没有分布,提示除M1亚型外的其它ipRGCs很可能参与了与dLGN相对应的成像视觉。由于M3~M5这些亚型的ipRGCs缺少各自独立的标记方法,目前的研究还没有对其投射的差异做出细致分析。需要指出的是,在灵长类动物恒河猴(Macaque)的视网膜中,Dacey等人发现ipRGCs的树突为单层分布。大约40%ipRGCs的胞体分布在内核层中,其树突在OFF亚层;60%ipRGCs的胞体分布在神经节细胞层中,其树突在ON亚层。ipRGCs在非成像视觉的功能方面具有重要作用。光线照射ipRGCs产生光反应后,其轴突末梢可以释放包括谷氨酸和垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptide,PACAP)在内的神经递质,从而调节昼夜节律等相关的功能。在正常情况下,可以利用单次光照改变暗养后的内源节律(约23h),使其产生相位后移(phaseshift);在缺失PACAP的情况下,则这种效应消失。此外,PACAP的受体在视网膜中也有表达,但是ipRGCs是否可以通过旁分泌的方式激活这些受体,以及其生理功能,目前还没有明确的解释,可能和神经元的保护相关。前文提到,缺少了光感受器的小鼠,由于ipRGCs能够直接对光反应,因此小鼠依然能够产生昼夜节律调节和瞳孔反射。但是,如果利用遗传学方法杀伤ipRGCs,光感受器不受影响,成像视觉不受影响,但小鼠的昼夜节律调节和瞳孔反射几乎完全消失,证明来自光感受器的信号在调控非成像视觉时,也必须通过ipRGCs。黑视素在视网膜中开始表达的时间很早,Hannibal等人发现在胚胎期大鼠视网膜上就能检测到黑视素的表达。在新生小鼠视网膜上,光感受器到神经节细胞的输入还没有建立,但利用钙成像或者多电极阵列进行记录,发现ipRGCs已经能够直接对光产生反应。同时,其投射的脑区SCN中,神经元活动的标志物c-FOS在光照后表达增加。如果敲除黑视素基因,c-FOS在SCN中的表达不再随光照变化。这些实验证明,出生时,ipRGCs已经具有感光功能且投射回路已经建立。与此相似,新生大鼠接受光照后,c-FOS在ipRGCs和SCN中的表达也有所增加。这种黑视素蛋白的早表达、ipRGCs感光能力的产生和对相关脑区的有效输入,对新生动物形成昼夜节律具有重要意义。研究人员还发现,新生小鼠已经具备了对光照的回避反应,而敲除了黑视素的新生小鼠失去光照回避反应,证明ipRGCs在光感受器出观感光功能前的新生小鼠具有重要的生物学意义。黑视素在早期视网膜中的表达,也会受到光线的调节:持续光照可以大幅度降低黑视素mRNA和蛋白在ipRGCs中的含量。光照改变黑视素含量的机制,还有待今后的研究来阐明。除了非成像视觉功能,ipRGCs也能够参与成像视觉的形成。在灵长类动物中,ipRGCs可以投射到成像视觉的相关脑区,如dLG