初诊肺结核患者外周血中cd4

初诊肺结核患者外周血中cd4

根据流行病学信息，现在核电站的发病率和死亡率最高。这种疾病的快速增长也受到了世界卫生组织的高度重视。以往多注重诊断、治疗、耐药等方面的研究,对其免疫功能的变化易忽视,而多数结核病患者都伴有免疫功能的异常,其结核病免疫是CD4+T淋巴细胞介导的细胞免疫应答,对结核病的发生、发展具有重要意义。CD4+T淋巴细胞因分泌不同因子而分为Th1和Th2型,其平衡与疾病的转归与愈合密切相关。为揭示肺结核患者体内Th细胞的极化特性,本研究应用流式细胞仪对患者外周血Th1/Th2进行检测分析,进而探讨其在肺结核免疫发病机制中的作用。1材料和方法1.1材料表面1.1.1结核性心脏病诊断标准肺结核组73例,(其中浸润型肺结核41例、结核性胸膜炎13例、粟粒型肺结核9例、肺结核合并糖尿病10例)。性别为男45例,女28例。年龄14～66岁,平均年龄为37.5岁。年龄、性别与对照组统计学处理无差异。临床诊断以《肺结核诊断和治疗指南》为标准。结核病确诊依据:①痰、胸水结核分支杆菌呈阳性,或活组织检查呈结核特征性病变;②X线胸片肺及其它部出现结核特征性病灶;③临床结核中毒症状明显、其它检查符合结核性特征;④抗结核治疗后病灶、胸水吸收快。具备上述标准三项以上者方可确诊。判断结核活动进展期、吸收好转期、稳定期的标准:①活动进展期:凡具备下列一项者属活动进展期:新发现活动性结核病灶;新出现空洞;空洞增大;病灶较前恶化;痰结核分支杆菌阳性。②吸收好转期:凡具备下列一项者属好转期:结核病灶较前吸收好转;空洞闭合变小;痰结核分支杆菌阴转。③稳定期:病变无活动性;空洞闭合;痰结核分支杆菌连续阴性(每个月至少检查1次,达六个月以上,如有空洞存在,则痰结核分支杆菌须连续阴性一年以上。1.1.2纳入及性别正常30例健康对照者均选自献血员及健康体检者。胸部X透视正常,近期无接触结核病史者。男20例,女10例。年龄20～60岁,平均35.7岁。PPD皮试5单位(IU)结果为阴性。1.2细胞剂和仪器鼠抗人CD3-PerCP、CD8-APC、IFN-γ-FITC、IL-4-PE、mIgG1-FITC,RatIgG1-PE,FACS细胞破膜剂和FACS细胞溶血素(两者使用前均用去离子水1∶10稀释)均购自BD公司。激活剂:佛波酯(phorbolmyristateacetate,PMA)于DMSO中调至浓度为0.1mg/ml,工作浓度为25ng/ml。协同刺激剂:离子霉素(ionomycin)于乙醇中配成浓度0.5mg/ml,工作浓度为1μg/ml。蛋白转运抑制剂:莫能霉素(monensin)溶于乙醇中调节浓度为0.1mg/ml,工作浓度为1μg/ml。不含谷氨酰胺的RPMI1640、二甲基亚砜(DMSO)等均为美国Sigma公司产品。FACSCalibur型流式细胞仪购自美国BD公司;TC2323水套式CO2培养箱为美国SL公司产品。1.3方法1.3.1样品采集空腹采集静脉血2ml于肝素钠抗凝管中,混匀备用。1.3.2细胞培养取肝素抗凝全血200μl,加RPMI1640培养液200μl混匀,取200μl加1∶1000稀释的PMA10μl,1∶100稀释的Ionomycin10μl,1∶10稀释的Monensin3.4μl,混匀后加入5%CO2培养体系37℃静置4小时或过夜。1.3.3facs破膜法检测流式细胞对照管和测定管分别加入培养全血100μl,依次加入抗人CD3-PerCP,CD8-APC荧光单克隆抗体10μl,混匀后室温避光反应15分钟。加入FACS1∶10稀释溶血剂2ml,混匀,室温避光15～20分钟。1300r/min离心5分钟后弃上清液。加入含叠氮钠无菌PBS2ml,洗涤后加1∶10稀释的FACS破膜剂各500μl,室温避光10分钟,加PBS2ml,混匀,1300r/min离心5分钟,弃上清。对照组加入mIgG1-FITC或RatIgG1-PE各10μl,检测组加入抗人IL-4-PE或IFN-γ-FITC各10μl,室温避光反应30分钟,加入2mlPBS洗涤后弃上清。用500μlPBS重悬细胞,利用流式细胞仪检测分析。以CD3+-SSC选定CD3+T细胞,为R1门,以R1设门,CD3-PerCP、CD8-APC作图选定CD4+T细胞,为R2门,对照管mIgG1-FITC、RatIgG1-PE作图划定阴性区域,再换测定管,检测IFN-γ、IL-4阳性细胞的含量(见图1)。1.4统计处理数据由SPSS12.0软件包处理,两样本均数(x—±s)(x—±s)用t检验。P<0.05为有显著性差异。2结果2.1th2细胞水平流式细胞仪检测结果显示,73例肺结核患者外周血中Th1、CD4+/CD3+细胞所占百分比较健康对照组显著降低(前者P<0.01,后者P<0.05),而Th2细胞水平较健康对照组显著升高(P<0.05,表1)。2.2th2的下降流式细胞仪检测结果显示,浸润性肺结核、结核性胸膜炎、粟粒型肺结核三组间外周血中Th1细胞比例逐步下降,而Th2则有所上升(表2)。三组间粟粒型肺结核与浸润性肺结核Th1、CD4+/CD3+水平有显著降低(P<0.05),与结核性胸膜炎、浸润性肺结核Th2水平比较有显著升高(P<0.05)。由此可见,随着患者CD4+/CD3+细胞降低,Th1/Th2细胞比值逐渐增高。2.3两组患者th1/th2比值的比较糖尿病并肺结核患者外周血中CD4+/CD3+的比值相对无糖尿病肺结核患者略小,免疫功能低下,两组间Th1/Th2比值有显著差异(表3)。2.4个月前后th1/th2、cd3+、cd3+水平的变化流式细胞仪检测分析结果经统计学分析表明,15例重度肺结核患者经结核化疗与微卡治疗三个月前后Th1/Th2、CD4+/CD3+的水平有显著改善(表4)。临床观察发现疗效显著(症状明显改善或消失,肺部病灶吸收良好)的患者外周血中Th1、CD4+/CD3+水平较治疗前明显升高(P<0.05),而Th2水平较治疗前显著降低(P<0.01)。2.5th1、cd3+、cd3+与cd3+评分的比较流式细胞仪检测结果显示,痰检或培养阳性与痰检阴性Th1、CD4+/CD3+比较有下降趋势但无显著差异(P>0.05),痰检或培养阳性与痰检阴性相比Th2细胞水平则有显著升高(P<0.05,表5)。3th2细胞数量的检测1986年,Mosmann等在小鼠模型上首次发现CD4+T细胞的两个亚群Th1与Th2,1991年Romagnan在人类病变组织浸润的淋巴细胞上也发现了同样的细胞特性。随后,许多学者对Th1与Th2在肺结核病理、生理过程中的作用机制展开了一系列的研究,结果表明,CD4+T细胞对结核分枝杆菌感染的保护性免疫作用主要是分泌多种细胞因子而放大免疫效应。Th1细胞主要分泌IL-2和IFN-γ,诱发细胞免疫应答,其中IFN-γ能够通过增强作为效应细胞的巨噬细胞表面人类组织相关抗原Ⅱ(MHCⅡ)分子的表达,促进巨噬细胞对抗原的递呈和自身的活化,启动机体的免疫应答。IFN-γ也可通过诱导巨噬细胞内某些介导呼吸爆发的酶的合成,使杀菌物质合成增加,赋予巨噬细胞更强的杀菌能力。同时,IFN-γ进一步促使Th0分化为Th1细胞亚群,增强Th1细胞免疫应答,有助于杀伤病原微生物。Th2细胞主要分泌IL-4和IL-10,有效激活B细胞产生抗体,参与诱导体液免疫应答。IL-4能抑制巨噬细胞的活化,拮抗IFN-γ活化巨噬细胞后的效应。因此,Th2细胞合成的细胞因子能减缓由巨噬细胞介导的免疫应答。有学者认为在刺激状态下IL-4表达增加与结核性空洞形成密切相关。所以,当这种平衡失调时,将直接影响结核病的进展。Th1和Th2分泌的多种细胞因子相互调节、相互抑制,对结核病的治疗和转归起着重要的作用。本研究中我们选取健康志愿者及不同程度的结核病患者外周血,应用流式细胞术进行一系列的分析,结果表明肺结核患者Th1细胞数量较健康对照组低(P<0.05),且随着病情加重呈现下降趋势,患者体内存在Th1、Th2细胞亚群的转化而使Th1、Th2的比例失衡,同时,CD4+/CD3+的比值与Th1呈正相关。我们认为,可能是病变部位CD4+T细胞和巨噬细胞的凋亡增强,而且该比值预示结核病恶化的倾向。体外研究发现细胞凋亡增强是与结核分枝杆菌反应性T淋巴细胞数目的减少或缺失同时发生的,从而导致宿主淋巴细胞对结核分枝杆菌的反应低下。Hirsch等认为结核分枝杆菌反应性T淋巴细胞凋亡的增加可能导致结核杆菌在宿主体内长期存在。有研究认为,结核病患者对结核分枝杆菌是以Th1细胞为主的细胞免疫抑制,Th1细胞的抑制能力与疾病严重程度密切相关。同时,Th2细胞数量增加提示疾病可能向重症发展。我们在痰检阳性和阴性两组病例比较中发现,阳性患者Th2细胞水平显著升高(P<0.05),胸片显示有空洞的占35.6%(16例)。由此推测,Th2细胞数量增加可能降低宿主的细胞免疫功能,使疾病向重症、排菌和空洞形成的方向发展。糖尿病并发肺结核患者由于免疫功能低下,使得IFN-γ的分泌量较低,其细胞免疫功能严重受抑,而IL-4水平却显著增加,使病情迁延难愈。15例重度结核病患者经结核化疗与微卡治疗后Th1和Th2细胞数量均显著改善。微卡治疗对人和动物无毒无害,具有与结核分枝杆菌相似的抗原表位和免疫原性,含有丰富的I型抗原和65kD抗原,可有效介导保护性免疫反应,促进Th1细胞分泌更多的IL-2和IFN-γ等细胞因子,进而激活巨噬细胞,使得巨噬细胞吞噬结核杆菌的能力增强。本研究中肺结核患者临床微卡治疗采用每周一次22.5μg肌注,三个月一疗程。研究结果提示,抗结核治疗和免疫辅助治疗相结合有助于提高患者机体的免疫功能,患者外周血中Th1细胞较治疗前增加(P<0.05