数字pcr技术的研究进展

数字pcr技术的研究进展

数字pcr（数字pcr，dpcr）是近年来发展起来的一项突破。1992年Sykes等检测复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因时,利用样品的有限稀释,让每个孔中只获得单个模板分子,通过计算PCR后的扩增信号,以期准确地确定起始分子的数量,虽然没有明确提出“数字PCR”的概念,但是已经建立了数字PCR基本的实验流程,并且确定了数字PCR检测中一个极其重要的原则——以“终点信号的有或无”作为定量方法。这是数字PCR的雏形。1999年Vogelstein等在检测粪便中进行癌变组织脱离细胞的BRAF特异突变型基因时,因受到体细胞基因的干扰,而碰到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈,而采用了在384孔板中对每个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式,从而提出了数字式PCR的概念,同时也提出如果采用更多孔板其检测灵敏度会更高,从而指出了数字PCR系统的发展方向。1反应单元荧光信号的统计数字PCR一般包括两部分内容,即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR扩增阶段,数字PCR先将样品稀释到单分子水平,再平均分配到几十至几万个单元中进行反应。与qPCR对每个循环进行实时荧光测定的方法不同,数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集,有荧光信号记为1,无荧光信号记为0,有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的。理论上,在样品中目标DNA浓度极低的情况下,有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA分子的拷贝数。但是,通常每反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子,就需要使用泊松概率分布函数(Poissondistribution)进行计算,根据反应单元总数、有荧光信号的单元数以及样品的稀释系数,就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。数字PCR的关键是稀释模板,通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元包含0个或一个(至多数个拷贝)的目标分子,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行统计学分析。(如图1所示)2泊松反应单元的确定数字PCR采用直接计数的方法进行定量分析,即在PCR扩增结束后有荧光信号的反应单元记为1,无荧光信号则记为0,有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子。理论上,在样品中目标DNA浓度极低的情况下,有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA分子的拷贝数。但是,在通常情况下,数字PCR的反应单元中可能包含两个或两个以上的目标分子,这时需要采用泊松概率分布公式(Poissondistribution)进行计算。上式中λ为每个反应单元中所含目标DNA分子的平均拷贝数(浓度),p为在一定的λ条件下,每个反应单元中所含k个拷贝目标DNA分子的概率。λ由样品的稀释倍数m决定,有λ=cm,其中c为样品的原始拷贝数(浓度)。当k=0(不含目标DNA分子)时,上式可简化为p=e-λ=e-cm,p可以看作是无荧光信号的反应单元数与反应单元总数的比值,即其中,n为反应单元总数,f为有荧光信号的反应单元数。上式两边取对数(ln)得到根据数字PCR反应单元总数和有荧光信号的单元数以及样品的稀释倍系数,就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。因为数字PCR通过终点检测计算目标序列的拷贝数,所以无需采用内参和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测;此外,由于数字PCR采用终点检测,因此也不依赖于Ct值,所以数字PCR反应受扩增效率的影响大大降低,对PCR反应抑制物的耐受能力也大大提高,具有很高的准确度和重现性。而且在数字PCR标准反应体系分配的过程(稀释过程)能够极大的降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度,因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。3反应单元的数目数字PCR的灵敏度,除了与检测器的灵敏度和PCR扩增效率等因素有关外,很大程度上取决于反应单元的数目。反应单元的数目越多,数字PCR的灵敏度越高,准确度也越高。根据反应单元形成的不同方式,主要有微反应室/孔板、微流控芯片和微滴等三类数字PCR系统。3.1反应单元数目对检测的影响早期的数字PCR技术采用96/384孔板作为反应单元。但是数字PCR技术的灵敏度取决于反应单元的总数,反应单元数越多越有利于提高灵敏度和准确度,普通的96/384孔板无法满足检测的需要。因此,出现了成倍提高反应单元数目的做法,反应体积从微升级降至纳升级。但是随着反应单元数目的增多、反应体积的减少,人工操作无法实现快速精准取样,就需要借助高通量自动上样设备,大幅提高了仪器成本和操作复杂性。(如图2所示)3.2组合单元法随着微流体技术、纳米制造技术和微电子技术等的发展,微流控芯片技术的使用使数字PCR能够快速并准确地将样品流体分成若干个独立的单元,进行多步平行反应,成本低、体积小和高通量,是理想的数字PCR平台。目前Fluidigm公司的Bio-MarkTM基因分析系统,LifeTechnologies公司的QuantStudioTM3D数字PCR系统均均为采用微流控芯片技术的数字PCR系统。3.3液滴数字pcrrod液滴数字PCR源于乳液PCR(emulsionPCR)技术,利用微滴发生器可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴,作为数字PCR的样品分散载体。PCR反应结束后检测每个微滴的荧光信号。通过油水两相间隔得到的以液滴为单位的PCR反应体系,更容易实现小体积和高通量,而且系统简单,成本低,因此成为理想的数字PCR技术平台。但是,上述技术需要将单拷贝DNA模板与磁珠同时包裹在一个液滴中,增加了系统的复杂性和定量分析的难度。目前RainDance公司的RainDropTM数字PCR系统,Bio-Rad公司的QX100系统、QX200系统均为采用液滴技术的数字PCR系统。(如图3所示)4dpcr技术的应用前景与传统qPCR技术相比,数字PCR技术具有极高的灵敏度、特异性和精确性,使其在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达分析、环境微生物检测和新一代测序验证等研究领域显示出巨大的优势和应用前景,已经有大量实验数据和结果证明了dPCR技术的优良性能(见表1)。5r的应用虽然数字PCR概念提出至今已经有二十多年,但其应用仍处于初级阶段,截止目前,