大鼠脊髓损伤后脊髓前角运动神经元的变化

大鼠脊髓损伤后脊髓前角运动神经元的变化

在过去的20年里，通过各种骨髓损伤（ic）模型的出现，对髓伤的研究也取得了很大进展。神经系统损伤修复后运动功能的恢复最终要依赖于运动终板结构的保存及其生理功能的恢复,由于周围神经是由脊髓神经元、神经干、外周靶器官三者组成的统一整体,那么脊髓运动神经元中必然存在具有维持外周靶肌肉形态、发挥运动终板功能的神经调制质。许多研究已经证实,降钙素基因相关肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)和乙酰胆碱酯酶(acetylcholineesterase,AChE)在该周围神经环路中发挥着及其重要的作用。1材料和方法1.1小鼠来源及免疫雌性Wistar大鼠由首都医科大学实验动物中心提供,体重225～250g,随机分成假手术组(A组,n=8)、切割型脊髓损伤组(B组,n=26)和撞击型脊髓损伤组(C组,n=26)。小鼠来源抗人CGRP多克隆抗体、碘化乙酰硫代胆碱:Sigma公司;生物素化抗鼠IgG、辣根过氧化物酶标记链霉卵白素:中杉试剂公司。1.2方法1.2.1髓组织损伤模型大鼠用6%水合氯醛6ml/kg腹腔注射麻醉,俯卧位固定于鼠板上,显微镜下暴露T8、T9脊髓。①切割型脊髓损伤模型:将脊髓硬脊膜打开,使用显微外科剪刀将一段长约3mm脊髓全部切除,然后用吸引器于软膜下吸断未横断的脊髓组织,确认此段无组织残留;术中采用压迫和电凝进行止血,9/0显微缝合线缝合硬脊膜,分层缝合肌肉、皮肤,碘酒消毒切口。②撞击型脊髓损伤模型:采用NYU(北京军区总医院全军骨科中心实验室进行)脊髓打击器,冲击重物为圆柱形,横断面直径2.5mm,质量10g,从距离T9表面60mm高度自由下落造成重度撞击伤模型。③假手术组模型:暴露T9段脊髓而不造成脊髓损伤。术后给予青霉素2×105U/次,2次/d,按摩膀胱2～3次/d,防止泌尿系统及其他并发症的发生。1.2.2常规精-伊红染色损伤组大鼠手术1周后,经4%多聚甲醛溶液灌注固定,取脊髓损伤处组织作常规石蜡包埋,纵行连续切片,片厚8μm,进行常规苏木精-伊红染色。1.2.3恒冷箱-20骨髓0.4重组切片采用Karnovsky-Roots直接法染色。术后1周、2周、4周、10周,B、C组大鼠各取6只灌注固定,取L2～L4脊髓节段进行恒冷箱(-20℃)脊髓横行冰冻切片,片厚30μm。切片入AChE孵育液[含醋酸缓冲液(pH=6.3)6.5ml、碘化硫代乙酰胆碱5mg、0.1mol/L枸橼酸钠0.5ml、30mmol/L无水硫酸铜1.0ml、双蒸水1.0ml、5mmol/L高铁氰化钾(GR及AR级)1.0ml],37℃孵育1.5～2h。蒸馏水洗3次,脱水,透明,树胶封片。1.2.4免疫组化处理术后1周、2周、4周、10周,B、C组大鼠各取6只灌注固定,取L2～L4脊髓节段进行脊髓横行冰冻切片,片厚30μm。0.01mol/LPBS-0.3%Triton-X100浸洗切片3次,每次5min,蒸馏水浸洗3遍,共10min。3%H2O2室温孵育15min。0.1mol/LPBS-0.3%Triton-X100浸洗切片3次,共10min。5%山羊血清室温孵育30min,直接入兔来源的CGRP多克隆抗体(1∶2000),4℃过夜。0.1mol/LPBS浸洗3遍,共10min。加入生物素化的山羊抗兔IgG(1∶300),室温孵育3h。0.1mol/LPBS浸洗3遍,共10min。加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(1∶300),室温孵育3h。DAB显色,室温20min。DW终止显色。苏木素复染细胞核。脱水,透明,树胶封片。1.2.5运动功能恢复情况采用联合均分(averagecombinedscores,ACOS)神经行为学评定观察大鼠后肢运动功能的恢复情况。大鼠术前适应行为学观察场地,每周评分1次,评分时间为1min,固定于晚间7:00进行。1.2.6角运动神经元的形态人类学观察和形态分析法应用LeicaQwin图像分析系统测量AChE和CGRP阳性染色部位的透光度值。1.3统计方法数值以(x¯±s)(x¯±s)表示,采用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析。2结果2.1术后1周后术后运动情况各组大鼠ACOS评分术前无显著性差异(P>0.05),总分均可达到310分左右。A组大鼠术后评分无明显变化;B组大鼠术后1周内后肢呈弛缓性瘫痪,爬行运动完全靠前肢带动;2周后部分大鼠出现后肢单或双关节的运动恢复;C组大鼠后肢在术后1周已经开始出现2个以上关节的大幅度运动。在随后的观察时间内,两组大鼠均出现明显的后肢运动功能恢复,C组大鼠ACOS评分始终高于B组,10周内每周评分结果两两比较均有非常显著性差异(P<0.01)(图1)。2.2髓组织损伤B组大鼠损伤处组织行HE染色,均证实为脊髓完全横断,切片上可见脊髓无明显肿胀,切口较整齐,脊髓组织在损伤处直径略微变细。在C组大鼠脊髓切片上,损伤处腹侧可见软脊膜完整,有约0.1～0.2mm厚正常白质结构残留。2.3各组大鼠ache阳性染色部位的比较正常L2～L4脊髓的前角AChE阳性反应明显,着色较深,可清晰看到前角运动神经元和部分神经元的突起(封三彩图2.1)。术后1周,B、C组大鼠前角运动神经元AChE着色与正常组无明显差异;术后4周,B组明显变浅(封三彩图2.2),C组稍有变浅(封三彩图2.3);术后10周,B组大鼠前角运动神经元AChE着色仍较浅,但C组大鼠与4周时相比有了明显的恢复。应用LeicaQwin图像分析系统分析,B、C组术后1周其AChE阳性染色部位的透光度与正常组相比无显著性差异(P>0.05);术后4周B、C组与正常组相比透光度明显增加(P<0.01),B、C组间相比也有显著性差异(P<0.05);术后10周C组大鼠虽然与B组相比有了明显的恢复,但与正常大鼠相比仍有非常显著性差异(P<0.01)(图2)。2.4免疫组化染色正常大鼠于L2～L4节段染色可见前角运动神经元胞浆被清晰标记,轮廓清晰,染色较深(封三彩图2.4)。B、C组大鼠术后1周CGRP免疫组化染色与正常组相比均明显变浅(封三彩图2.5、图2.6);术后4周时,B组CGRP阳性染色仍较浅,C组CGRP免疫组化染色与1周时相比明显加深;术后10周时,B组大鼠阳性染色神经元轮廓仍不清晰,且阳性标记的运动神经元变少,但C组阳性染色神经元轮廓较清晰,与正常组相比无明显差异。应用LeicaQwin图像分析系统分析,B、C组大鼠损伤1周后CGRP阳性染色部位的透光度值较正常组大鼠明显增大(P<0.01),B、C两组相比无统计学差异(P>0.05);术后4周及10周时,B组与正常时相比透光度明显增加(P<0.01),而C组与正常组相比无统计学差异,B、C两组间相比有显著性差异(P<0.05)(图3)。3c组不同处理治疗股骨损伤后的前角运动神经元检测大鼠胸髓完全横断未接受任何干预措施的情况下,仍存在后肢运动功能的自发性恢复。这种自发恢复的机制与损伤部位以下腰骶段脊髓内的低级步行控制中枢——中枢模式发生器(centralpatterngenerator,CPG)有关。许多动物的脊髓都存在CPG,由脊髓中间神经元组成,之间有神经信号通讯,其所构成的网络可使脊髓在完全失去下行运动神经支配和上行感觉传入的情况下产生一些节律性运动。2005年,Guertin提出了对胸髓损伤大鼠后肢运动功能进行半定量评价的ACOS评分,将大鼠后肢的运动分为交替和非交替两种类型,关节的运动幅度分为3个等级,观察大鼠在1min内交替和非交替运动的次数,然后将以上指标整合起来进而得到一个数值,从而对脊髓损伤后大鼠的运动行为进行半定量分析。该方法与传统的BBB评分相比,能从量上体现功能的细小恢复变化,且BBB定性评分法主要是为存在白质纤维残留的不完全脊髓损伤而设计,对于评价脊髓完全横断损伤后的自发恢复不够敏感,而ACOS评分对所有类型脊髓损伤均适用。通过评分发现,两种脊髓损伤后,后肢运动功能均出现一定的自发性恢复,损伤4周以内恢复较快,以后逐渐趋于稳定,C组大鼠由于残留纤维及CPG的双重作用,后肢功能的恢复要明显优于B组。脊髓损伤后运动功能出现不同程度的自发性恢复,作为脊髓重要结构之一的前角运动神经元一定起着十分重要的作用。Nakamura研究表明,大鼠颈髓不完全性损伤后,前角运动神经元内AChE活性变化与运动功能恢复具有较强的相关性。AChE主要来源于运动神经元胞体,通过轴突快速运输到达神经终末,各种形式的AChE都能在脊髓运动神经元和骨骼肌细胞中找到;AChE活性的强弱可反映运动神经元的功能状态。脊髓损伤后由于继发的缺血、缺氧,导致了前角运动神经元内AChE的活性减弱。朱悦等研究发现,脊髓不完全性损伤后脊髓前角运动神经元内的AChE活性减弱,但随着时间的延长而有所回升。Krikorian发现,大鼠脊髓横断伤后运动神经元胞体和纤维中AChE活性于术后14个月内持续减少,认为这种变化可能与脊髓损伤的程度较重有关。CGRP与脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复也有着密切的关系。它在神经细胞胞体合成,在感觉和运动神经纤维中经逆行和顺行轴浆运输在神经元和神经末梢之间进行传递。CGRP能调节中枢神经系统及周围神经系统的突触传递。Marlier等观察到,大鼠脊髓横断后,前角运动神经元中CGRP随时间推移(2d～5个月)而减少,并且推测可能是由于脊髓横断后导致前角运动神经元失去了上运动神经元对其CGRP合成的促进信号,从而使得CGRP含量减少。本实验显示,在术后1周,损伤平面以下运动神经元CGRP免疫组化染色阳性部位的着色明显变浅,这与前人报道基本相符。然而,我们还发现,C组大鼠由于损伤的不完全性,术后4周CGRP在前角运动神经元的含量有了明显的提高,与正常时相比无显著性差异;脊髓损伤后早期损伤平面以下运动神经