aqman荧光定量pcr快速检测方法在登革热诊断中的应用

aqman荧光定量pcr快速检测方法在登革热诊断中的应用

登吉热（df）是由登吉热1.4病毒（dv1.4）引起的急性流行病。DV感染除引起登革热外,严重的还可导致登革出血热(denguehemorrhagicfever,DHF)或登革休克综合征(dengueshocksyndrome,DSS)。DV主要通过埃及伊蚊(Aedesaegypti)和白纹伊蚊(Aedesalbopictus)传播,广泛流行于全球的热带和亚热带地区,我国主要分布于广东、海南、广西、福建、台湾等省(自治区)。登革热诊断常用的血清学和病原学检测方法,由于抗体从出现到可检测水平,通常需要5~7d,同时登革热抗体与其他黄病毒存在交叉反应,故血清学检测作为早期诊断方法仍有一定的局限性;DV的分离鉴定是该病最可靠的诊断方法,但由于试验耗时较长,敏感性低,不能作为早期诊断方法。近10多年发展起来的DV核酸检测技术,为登革热的早期诊断提供了可能,如RT-PCR可在患者发病1d内进行DV的鉴定和分型,是目前较好的登革热早期诊断方法,但该法也有它自身的缺陷,容易造成阳性标本间的交叉污染而得到假阳性结果。近年来一种基于TaqMan荧光探针的荧光PCR检测技术成功应用到DV的检测上,相对于常规的PCR技术而言,具有更高的敏感性、特异性和重复性,并具有快速、高通量、污染少等特点。本研究以TaqMan探针技术为基础,建立了一套登革热早期快速诊断方法。自1978年广东省佛山市暴发登革热以来,我国南方部分省区该病流行不断,2006年广东省又发生了DV1的流行。本研究建立敏感特异的DV1型one-stepReal-timePCR(RT-PCR)检测法,并对感染了DV1的登革热患者血清标本进行检测,现报道如下。1材料和方法1.1病毒属virusDV1~4型标准毒株:DV1Hawaii株、DV2NewGuineaC株、DV3H87株、DV4H241株;8株DV1广东地方株:GD03/91、GD23/95、GD14/97、GD05/99、GD23/2003、GD66/2003、GD01/2006、GD02/2006;3株黄病毒:西尼罗病毒(WestNilevirus,WNV)、流行性乙型脑炎(乙脑)病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)、黄热病毒(Yellowfevervirus,YFV);3株甲病毒:西门利克病毒(Semilikiforestvirus,SFV)、基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus,CHIK)、辛德毕斯病毒(Sindbisvirus,SIN)及C6/36细胞均由广州军区疾病预防控制中心保存。病毒液均为病毒接种C6/36细胞,病变后收集的上清液。本研究所用的40份DV1患者血清均收集于广州地区2006年登革热疫情发生期间(由广州市第八人民医院提供),其中36份血清采集时间为患者发病1~7d,4份采集时间为7~9d。1.3引物及探针的合成及纯化用DNAMANVersion6序列比较软件分析从GenBank上获得的85株DV1核苷酸序列,发现DV1的保守序列,选取DV1全基因组5′端非编码区保守序列作为特异性引物和探针设计的区域,用PrimerExpress2.0软件(AppliedBiosystemsFosterCityCalif)设计引物及TaqMan探针(表1),探针5′端标记FAM(6-carboxyfluorescein)荧光基团,3′端标记TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine)淬灭基团,引物和TaqMan探针由上海基康生物技术有限公司合成、标记及纯化。1.4血清抗体试验，hd1参照DV-IgM/IgGELISA试剂盒说明书进行。1.5dv1阳性对照rna模板的制备用以上设计的引物RT-PCR扩增DV1标准毒株所得的产物经纯化回收后,分别克隆于pGEM-TEasy质粒上,再用上述引物对重组质粒进行PCR鉴定正确后,取PstⅠ限制性内切酶线性化重组质粒,用PCR片段纯化试剂盒纯化线性DNA,采用T7RNA聚合酶体外转录RNA试剂盒将线性质粒转录为RNA,并经RNeasyKit纯化2次后,用分光光度计260nm对其进行定量,然后分装冻存于-80℃,检查样本时将其按不同方法进行稀释,即为DV1阳性对照RNA模板。1.6rna提取取140μl发热患者血清或细胞上清液,加入Trizol试剂和氯仿后,离心,取上层水相加入等量异丙醇沉淀,提取总RNA,最后用50μlDEPC处理水溶解,可直接用于实验,剩余分装冻存-80℃保存。1.7荧光定量pcr检测应用one-stepRT-PCRMasterKit,取2μl病毒RNA、上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl及TaqMan探针(2pmol/μl)1.5μl,10μlone-stepRT-PCRMasterMix(Qiagen),总体积加水至20μl。扩增条件:按50℃30min、95℃15min,再按95℃15s、60℃60s,40个循环。阴性对照取DV2、DV3、DV4标准毒株、3株黄病毒(WNV、JEV、YFV)和3株甲病毒(SFV、CHIK、SIN)、C6/36细胞、正常人细胞的RNA以及DEPC水作模板,同时将上述阳性标准品与样本同条件实时荧光定量PCR。实验重复4次,验证检测体系的稳定性。在ABI7300PCR仪反应完毕后,由计算机自动绘制标准曲线并报告数据。上述扩增结束后,于每个反应管取5μl产物,在1%琼脂糖上电泳,观察扩增结果,同时送北京华大基因研究中心ABIPRISM®3730测序。此外,对每一个浓度的病毒稀释液做5次重复检测,得到的Ct值采用Stata8.0软件计算标准差。2结果2.1dv1的检测敏感度取阳性对照模板,测定A260光密度值后定量,然后用DEPC水连续10倍稀释成4×108~4×10-2拷贝/μl,连续2倍稀释成4×10~7.8×10-2拷贝/μl,按每一反应管内加2μl提取的RNA,DV1的检测敏感度为10拷贝/反应~4×108拷贝/反应(R=0.9976)(图1)。2.2阳性扩增曲线用上述方法进行特异性检测,DV1标准株和8株DV1地方流行株均可见到阳性扩增曲线,检出率为100%;DV2、DV3和DV4标准毒株、3株黄病毒(WNV、JEV、YFV)、3株甲病毒(SFV、CHIK、SIN)、正常人细胞、C6/36细胞的RNA以及DEPC水结果均为阴性。2.3elisa-igm法将40份发病后不同时间采集的登革热患者血清标本按上述方法进行检测。其中用TaqManRT-PCR,28份血清标本检测到阳性,检出率为70%。ELISA-IgM法,20份血清标本检测出阳性,检出率为50.00%。ELISA-IgG法,9份血清标本检测出阳性,检出率为22.50%。发病1~3dRT-PCR、ELISA-IgM、ELISA-IgG法阳性检出率分别为81.25%、12.50%和0;发病4~6d阳性检出率分别为65.00%、85.00%和30.00%;发病≥7d阳性检出率分别为50.00%、25.00%和75.00%(表2)。2.4dna片段的获得将所有TaqManRT-PCR扩增产物,通过琼脂糖电泳和ABIPRISM®3730测序,可得到约120bp的DNA片段,完全符合实验设计。3在快速诊断中的应用本实验分析了GenBank中DV1各基因型共85株的全基因组序列,选取DV1型中最保守区域设计探针引物,使探针更具特异性。实时荧光定量PCR技术所用的标准品,常用的是体外转录的RNA模板、质粒DNA模板和纯化PCR产物模板。DV作为一种RNA病毒,体外扩增前必须先经反转录酶转化成模板cDNA,才能完成余下的PCR扩增,因此,实验中用设计的引物RT-PCR扩增DV1标准株,并取得产物,采用体外转录的方式获得RNA模板,从而完成定量的阳性标准品制备,对DV1核酸起到较为精确定量的作用。考虑到DV1与DV2、DV3、DV4及其他黄病毒属成员有着抗原性交叉的问题,因此我们选取DV2、DV3、DV4标准毒株以及黄病毒和甲病毒代表株来评价该方法的特异性。结果显示,该方法具有较高的特异性,按该法操作不会与黄病毒和甲病毒发生交叉反应。我们还选用8株不同时期、不同基因型的DV1广东地方株作为阳性对照,通过反复实验,证实我们设计的DV1探针和引物特异性较好。本研究以新建立的TaqManRT-PCR快速诊断方法与传统的ELISA法进行检出率比较。在对发病后不同时间采集的登革热患者血清检测中发现,发病1~3dRT-PCR的阳性检出率最高(81.25%);4~6dELISA-IgM检出率最高(85.00%);在7d后ELISA-IgG的检出率最高(75.00%)。血清中抗原和抗体的检出情况完全符合机体对病原免疫应答的规律,在发病1~3d因为机体免疫系统还未大量产生可中和病毒的抗体,故RT-PCR的阳性检出率最高;发病4d后,机体产生的特异性IgM和IgG逐渐发生中和作用,降低了血清中的病毒载量,故ELISA-IgM、IgG法阳性检出率要高于RT-PCR。因此,在登革热的早期诊断中本研究建立的RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可用于DV1的快速诊断。由于广东省登革热的流行一直趋向于DV1型,血清标本的采集是伴随着登革热疫情暴发以后而获得,其他血清型DV2、DV3、DV4标本的采集难度较大,因此,我们将在以后获得足够检测标本的同时,继续完善该检测体系,进行DV2、DV