浅析我国减毒活疫苗的研究进展

浅析我国减毒活疫苗的研究进展

自然界有四种类型的病毒（den-4），不同类型之间存在一些免疫交叉。登革病毒颗粒核心由单股正链RNA与壳蛋白C构成,脂质包膜由包膜蛋白E和前膜蛋白M组成,基因组编码3种结构蛋白:C、M/prM、E,及7种非结构蛋白:NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5。近20年来登革病毒感染率明显上升,目前每年有超过8千万人感染,其中约有24000例死亡。疫苗开发迫在眉睫。理想的登革疫苗应该具备以下3个基本特点:(1)能诱导人体产生针对四型登革的终生免疫,且无不良反应;(2)适合婴儿使用;(3)接种时或接种后暴露于野生毒株下,不会增加人体发生登革出血热/登革休克综合征(DHF/DSS)的几率。目前的研究主要集中在四种疫苗形式:灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗及减毒活疫苗。其中减毒活疫苗经济且免疫原性较好,因而成为人们关注的焦点。理想的减毒株应符合以下几条原则:(1)能够诱导出与自然状态相近且持久的细胞和体液免疫;(2)减毒疫苗在体内的复制程度能被严格控制,以免人体产生严重的病理反应;(3)对蚊的传染性低(如果能在人体内保持较低的血清滴度就能做到这一点);(4)易于使人类获得免疫力;(5)能够充分诱导出四个型登革病毒的平衡的中和抗体;(6)最好还要能分析清楚每一型疫苗减毒的基因改变,这样就能够监控疫苗基因的稳定性。1减少有毒基因1.1wrair接种疫苗后的免疫反应传统减毒活疫苗是在敏感细胞上或动物体内连续传代后获得的一种病毒突变株。其减毒的原因为传代引起的核苷酸或氨基酸的变化,且传代次数增加突变位点增多。泰国Mahidol大学疫苗发展中心(Bangkok)和美国WalterReed陆军研究所(WRAIR)均采用多通道细胞培养法,利用PDK、PGMK等细胞对亲本病毒连续传代进行减毒。他们的工作都非常出色。Mahidol大学疫苗发展中心获得四个型的减毒株DEN1PDK13、DEN2PDK53、DEN4PDK48、DEN3PGMK30F314,给志愿者接种2~3次后超过80%的人产生了针对四型登革病毒的血清转化。但后来发现疫苗不能达到各型间免疫应答的平衡,且免疫反应性过强,前景并不十分乐观,为此巴斯德研究所停止了与其的合作。WRAIR经过一期临床试验及进一步探索筛选得到的减毒株:DEN1PDK20、DEN2PDK50、DEN3PDK20、DEN4PDK20,它们具有较强的免疫原性,且不良反应弱,志愿者能较好耐受,目前正在北美和东南亚进行二期临床试验。WRAIR还发现:曾感染过黄病毒的志愿者在一次接种疫苗后就产生了针对四个型登革病毒的中等程度的免疫反应,而未感染过黄病毒的人中只有25%获得了低到中度的四型免疫反应,63%的人产生了针对其中三个型的免疫反应。提示在临床研究中同源(登革)或异源黄病毒等诱导的抗黄病毒免疫反应应加以重视,尤其是在黄病毒流行的区域。目前传统减毒活疫苗发展相对较成熟,但仍有两大问题需做出进一步探索:(1)如何使减毒株在保留最大的免疫原性的同时将免疫反应性减小到最低水平;(2)如何减小不同型别间的干扰作用。2新型抗毒感染苗2.1den3/430登革病毒基因组的5’端和3’端各有一段非编码区。此序列缺失后可能会改变基因组RNA的二级结构以及RNA与结构蛋白的相互作用,从而影响登革病毒的增殖和感染过程而导致减毒。Durbin等利用反向遗传技术使DEN4cDNA的3’端缺失30nt,构造出单价的减毒株rDEN4△30。二期临床试验结果表明:rDEN4△30安全性和稳定性较好,具有一定的免疫原性,且对蚊子的感染力有限。缺点是引起志愿者不良反应较重,且传播过程中减毒特性不稳定。有学者在rDEN4△30的基础上构建了两个更为减毒的突变株,现正准备进行三期临床实验。用同样方法获得DEN1的减毒株rDEN1△30,减毒性和免疫原性良好,也有类似rDEN4△30的不良反应。但这种办法对DEN2和DEN3减毒效果似乎不佳。于是学者们转换策略,以rDEN4△30为骨架将DEN2、DEN3的PrM和E蛋白的基因插入其中,构造出减毒株DEN2/4△30以及DEN3/4△30。动物实验显示DEN2/4△30和DEN3/4△30均高度减毒,对埃及伊蚊感染力弱。对DEN2/4△30的一期临床试验显示,在剂量为103pfu时该疫苗有良好的安全性和免疫原性,目前对DEN3/4△30的临床测试正在进行。Blaney等把DEN1△30、DEN4△30、DENN2/4△30和DEN3/4△30组合在一起构造的四价疫苗,不仅减毒特性良好,还能够使恒河猴产生免疫保护作用。这项研究很有前景,只是迄今为止人们还没有做过有关该四价疫苗的稳定性的探讨。2.2型登革病毒的血清转化嵌合体疫苗是指以病毒保护性抗原基因取代非致病或弱毒性病毒载体基因组相应位置而获得的一类疫苗。不同型别、不同种别病毒的蛋白嵌合表达会导致蛋白-蛋白或蛋白-RNA间相互作用的改变而导致减毒。嵌合体疫苗可分为型间嵌合疫苗和种间嵌合疫苗。疫苗ChimeriVax是以YF-17D疫苗作为载体,插入登革病毒的Pr-M和E蛋白的基因,取代序列上原有的Pr-M和E蛋白的基因。现已构造了四种血清型登革病毒的嵌合体(ChimeriVaxDEN1-4),在预临床试验和临床试验结果中显示减毒充分并保留了免疫原性,且不能在埃及伊蚊的中肠组织中感染和复制。一期临床试验对未感染过黄病毒的志愿者进行一次免疫后,43%的人出现了针对四型登革病毒的血清转化,滴度可调控,安全性较高,且没有严重的人体副反应。另有学者将四个型登革特异性抗原基因插入腺病毒基因组中构造减毒株,100%预防了病毒血症的发生。2.3有组配体的减毒剂登革病毒E、PrM、NS1蛋白等基因中存在十余个与乳鼠神经毒力有关的位点,对这些位点进行定点诱变可获得减毒。但由于存在回复突变的存在,这类疫苗进展缓慢。有学者对病毒基因组的3’非翻译端进行了修饰,同时在不改变prM和E蛋白区域的情况下,对某些非结构基因进行了定点突变修饰,从而构造出了一种新型减毒株。该减毒株在恒河猴体内的单价疫苗免疫试验中显示:滴度高度可调,以及不同程度的减毒。据此研制的四价疫苗在猴体内能诱导出针对四个型的广泛的中和抗体。该疫苗由于能够诱导出高滴度的中和抗体及引起病毒血症水平较低而受到重视。2.4黄病毒家族衣壳蛋白的培养以前人们都认为黄病毒的衣壳蛋白是不可缺少的,但Kofler等通过对黄病毒家族另一成员蜱传脑炎病毒(TBE)的研究发现其衣壳蛋白具有一定的功能灵活性。黄病毒家族衣壳蛋白均存在保守的内部疏水序列,缺失了这段疏水序列,则可能影响到黄病毒核衣壳的正常组装,从而获得免疫原性较高的减毒病毒。同时由于病毒基因组两端的非编码序列保持完整,因而不影响其增值能力,而且还可以降低回复突变率。我国学者朱武洋等通过缺失衣壳蛋白C内部疏水区的办法对DEV2型中国分离株DEV2-43的进行减毒。该减毒株减毒充分并能在成熟的小鼠体内诱导出中和抗体。由此提出了一种构建新型减毒疫苗的方法:以C蛋白作为登革病毒减毒靶点。3要解决这些问题3.1基于免疫活性模型的疫苗安全性评价登革疫苗研制中最大的挑战在于缺少一个合适的动物模型。目前有INF受体缺陷的AG129小鼠、嫁接了人类CD4+T细胞的免疫缺陷小鼠等几种用来区分不同登革候选疫苗的向神经性乳鼠模型。由于它们在感染DEN2后产生与人类似的反应,暂时用其评估抗登革病毒药物的疗效。WHO推荐用灵长类动物来评价减毒黄热病疫苗的向神经性和驱内脏性。但是灵长类动物感染后不出现临床症状,仅仅是短暂性出现病毒血症,所以人们只能通过检测病毒血症来间接评估疫苗的安全性。由于保护性的免疫原性和病毒血症的参数值很难确定,外推到人时就只能大致依据野生型感染状况来评价感染分度。事实上,目前而言人体是最好的模型。3.2型登革免疫登革疫苗的目的是要诱导出显著而平衡的针对四型登革的免疫反应。但某些临床试验中观察到,同时行四型疫苗接种后,针对其中一个或两个型的免疫会占主导地位,而针对其他型的免疫反应相对较低甚至压根没有。目前大多数学者认为:体内存在的异型抗体或亚中和浓度的抗体会形成病毒抗体复合物,并通过IgG的Fc受体(FcR)结合到单核细胞系表面,随着吞噬作用病毒进入细胞内,复制后引起单核细胞系感染,产生过量可溶性的前炎症介质并激活补体,从而引起DHF/DSS。即,异型抗体或亚中和浓度抗体可能会使病情加重。因此克服四型登革免疫之间干扰作用就成为疫苗发展的一个挑战。WRAIR认为多次免疫能解决该问题,但此法比较麻烦在经济条件不发达的疫区不实用。要使疫区人们尽快获得抵抗能力最好将接种次数控制在两次以内。现在有学者正尝试把四型登革保护性抗原表位用分子育种的办法嵌合到一起来克服干扰问题。3.3免疫反应的质量临床研究方面目前面临最大的三个困难:(1)现在人们都把血清抗体的出现作为登革免疫保护的主要标志,并利用噬菌斑减少中和试验检测其免疫反应的程度,但目前其相关的滴度参数仍有待确定;(2)三期临床试验仍缺少长期安全性和免疫原性的参数;(3)接种过疫苗是否能够抵抗野生型病毒的感染,只有志愿者们经历野生种登革病毒的流行后才能知晓,且研究人员必须长期追踪监测,而这是一项非常难实现的工作,因此最好要有一套能提前预测的参数。4做好疫苗的研发虽然登革疫苗研究中仍存在很多有待解决的问题,但近年来研究工作确实取得了非常大的突破。传统登革疫苗发展得较早,目前美国WalterReed陆军研究所研制的四个型的疫苗已经进入二期临床试验。以反向遗传技术为基础的3’UTR缺失突变疫苗取得了令人欣喜的结果,这也是当前登革新型减毒疫苗的研究重点。衣壳蛋白缺失突变疫苗也值得深入探讨。虽然诸多结果令人振奋,但我们仍面临着没有完美的动物模型、型间干扰作用、缺少临床研究参数等问题。进一步的研究需要科学工作者的共同努力,同时需要全世界投入更多的经费来支持这项事业。在如今登革疫苗迅猛发展的形势下,我们可以预计合格的登革疫苗将会在不久的将来获得批准上市。5’UTR-257C→T,NS1-53Gly→Asp和NS3-250