鼠胚胎发育时期骨发育异常研究进展

鼠胚胎发育时期骨发育异常研究进展

发育是一个极其复杂的过程，尤其是异常的胚胎阶段发育，通常与生命科学领域的各种学科有关。胚胎时期骨发育异常不但引起患儿身体严重畸形及功能障碍,而且导致患儿的日常生活、学习都无法正常进行,这给家庭和社会都带来了沉重的精神和经济负担。为了提高人口素质、改善生活质量,医疗界科研人员不断探索引起胎儿骨发育异常的作用机制。随着现代科学技术的发展,用于研究胎儿骨骼发育的科研方法也随之得到改进,致使许多骨发育异常的病因、病理都得到阐明。国内外科研人员对胚胎时期导致各种骨发育异常,甚至畸形的病因,病理从结构到功能、从整体到分子水平进行系统的研究。例如采用Neubert300分评分方法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的(TUNEL法)检测骨密度、检测骨细胞的凋亡、检测体外培养液中与骨发育密切相关的酶技术、测定胎鼠肢芽蛋白质、测血钙水平、检测3110009F21Rik基因表达技术、X-ray骨密度观察技术等均用来检测鼠胚胎发育时期骨发育机制。其中利用阿利新蓝单染法或阿利新蓝-茜素红双染法对特殊制作的鼠胚胎骨骼标本进行染色的技术,是检测胎鼠骨发育最可靠、快捷的好方法。胎鼠的骨骼经染色处理后常在体视显微镜下观察分析骨骼形态、计算骨数,对胎鼠软骨或骨进行评分、评级分析来检测骨发育的技术手段。Neubert最早创建半定量Neubert300分评分方法,应用阿利新蓝染液对胎鼠前肢芽进行染色后,于体视显微镜下直接观测分析软骨外观形态、前肢芽各骨的Neubert得分,通过分析各软骨的Neubert得分来评价软骨的发育程度是否正常。国内学者钟永盛等对造模的先天性马蹄内翻足(CCF)胎鼠后肢芽进行阿利新蓝染色并经过透明处理,在体视显微镜下观测分析软骨外观形态、后肢芽各骨的CCF得分,使用CCF专用评分体系评测后肢芽软骨发育情况(CCF评分系统是根据Neubert评分体系转化而来的)。胎鼠上枕骨的骨化0~Ⅳ评级是用阿利新蓝-茜素红双染法对胎鼠颅骨进行染色、透明处理后常用来评价宫内胎鼠的上枕骨发育情况,对各实验组胎鼠的枕骨评级从而分析受试药对枕骨发育细微影响。Neubert300分、CCF评分系统、上枕骨的0~Ⅳ骨化评级方法是对胎鼠骨发育进行半定量评分(或评级)(检测项目包括:骨计数、骨发育面积半定量、骨生长发育形态等多方面综合分析)的实验方法,与以往骨发育实验中单一对发育骨骼计数或形态观察相比,对骨进行半定量评分(或评级)实验结果数据综合了受测实验胎鼠标本的多方面信息,实验数据更具有科学依据。本文介绍检测胎鼠骨发育研究中常用、简便、可靠的尤其是对骨发育程度量化的3种检测骨发育方法,现综述如下。13.评估大鼠骨骼发育的三种方法1.1半定量非urt300分评价方法1.1.1液体外培养布完整切取在母鼠体内发育至45~56体节的胎鼠前肢芽,立即将前肢芽经BGJb全培养基清洗,然后用添加受试药物的BGJb培养液体外培养前肢芽3~6d。将培养好的前肢芽依次用蒸馏水洗净,再用包音氏(Bouin′s)液固定,再用75mg/mL阿利新蓝染液中对前肢软骨进行染色,最后经脱色、由低到高乙醇梯度脱水、二甲苯透明、松木油保存待评分检测。1.1.2“7.3评分”评分(1)将用松木油保存待测的前肢芽用70%乙醇洗净,然后置洗好的前肢芽于载玻片上,在体视显微镜(10倍)下观测肩胛骨、肱骨、尺骨、桡骨、腕骨和掌指骨各软骨的外形分化情况。(2)用半定量Neubert300评分体系评价前肢芽软骨分化,Neubert300评分系统将胎鼠前肢芽分成长骨和掌骨两部分,各部分最高评分均为150分。其中长骨又分肩胛骨、肱骨、尺骨、桡骨和腕骨,设置各骨最高Neubert评分为30分。掌骨又分为第1~5掌指骨,各掌指骨最高Neubert评分为30分。经组织学处理的前肢芽软骨清晰可见,再加上是在体视显微镜(10倍)下观测肩胛骨、肱骨、尺骨、桡骨、腕骨和掌指骨各软骨,故前肢芽软骨外形分化情况、Neubert评分数据可信度极高,误差很小。胎鼠前肢芽Neubert评分得分越高表示软骨发育越好。前肢芽的各部分软骨所得评分相加即为单个前肢芽的软骨发育分化的Neubert评分得分。1.1.3数据分析用SPSS17.0秩和检验法分析单个前肢芽总评分数据。1.2ccf对后代芽的评价方法1.2.1胎鼠术后芽剖开经母鼠体内用受试药物造好模的孕鼠子宫,立即取出胎鼠,分离羊膜并完整切取胎鼠后肢芽。然后用蒸馏水洗净后肢芽,再用Bouin′固定过夜后取出,依次经100mg/mL阿利新蓝染液染色、乙醇梯度脱水、二甲苯透明处理后再经香柏油保存待测。1.2.2胎鼠术后芽的骨发育情况(1)将待测的后肢芽用70%乙醇洗净后置于载玻片上,在体视显微镜(10倍)下观测髋骨、股骨、胫骨、腓骨、跗骨和第1~5趾骨、跖骨的发育情况。(2)用CCF评分系统分析胎鼠后肢芽的骨发育分化,此法以21d(初生)的大鼠胚胎后肢芽软骨骨化定为后肢芽软骨发育的最佳标准。即CCF评分体系对胎鼠后肢芽软骨发育完全定为300分:单个后肢芽的髋骨、股骨、胫骨、腓骨、跗骨分别定为30分,共150分;第1~5趾骨、跖骨各30分,5个共150分。后肢芽所得CCF评分越高说明后肢芽发育越好。1.2.3数据分析用SPSS17.0统计采用单因素方差分析后肢芽的CCF评分数据。1.3枕骨化程度1.3.1内脏器器官清理将经体内用受试药物造模成功的实验孕鼠麻醉,然后剖腹取出胎鼠。先将胎鼠的皮肤完整剥除干净,再依次取出胎鼠胸腔内的心、肺、肝、肠等内脏器官,最后剔除皮下脂肪。先入阿利新蓝染液中进行染色至标本呈蓝色,蒸馏水洗净滤干后再入茜素红应用液中染色处理,最后再经甘油由低到高浓度梯度透明处理,100%的甘油保存经阿利新蓝-茜素红双染的标本备检测。1.3.2骨化程度评级(1)将待测的胎鼠颅骨在体视显微镜(10倍)下观测上枕骨的骨化大小情况。(2)上枕骨骨化程度的分级标准:上枕骨的骨化程度评级级别越低表示骨化越好,即表示上枕骨发育越好。上枕骨的骨化程度评级标准如下,0级:上枕骨的两侧骨化点已经连接并且连接处的宽度大于原始骨化点处1/3,整个上枕骨呈片状或哑铃状;Ⅰ级:上枕骨2侧骨化点有相连,但连接处宽度小于2侧原始骨化点处的1/3;Ⅱ级:上枕骨2侧骨化点不相连,2个骨化点较大;Ⅲ级:上枕骨2侧骨化点不相连,仅见到很小骨化点;Ⅳ级:无上枕骨骨化点。1.3.3采用spss17统计法，通过ii检验分析上枕骨评级的实验数据2实验结果与分析胎鼠前肢芽半定量Neubert300分评价方法、后肢芽CCF评分方法以及上枕骨的0~Ⅳ骨化程度评级,此3种对胎鼠的骨发育评价方法在传统的计数、形态学统计基础上,进一步对骨发育进行定量评价。尤其是对胎鼠肢芽骨发育进行评价的Neubert、CCF评分体系对肢芽各类骨骼细分并有各自的评分标准,这样更能检测出药物对肢芽发育影响具体作用的胚胎发育时期以及对哪部分骨骼会导致骨骼发育迟缓甚至致使骨骼畸形。对肢芽骨发育评分的Neubert、CCF评分体系及枕骨骨化程度评级对肢芽发育评价在常见的骨染方法定性的基础上对骨发育进行定量分析,更能检测出受试药物对胎鼠骨发育影响的量-效关系。需要强调的是,在实验过程中一定要遵循各实验组的动物饲养、标本制作、染色必