abc免疫组织化学技术在自发性高血压大鼠脑室触液神经元中的应用

abc免疫组织化学技术在自发性高血压大鼠脑室触液神经元中的应用

在动物的中枢神经系统中，有一个与脑脊液接触的中枢神经（csjn）。它们位于脑室腔、室管膜或脑实质，它们通过细胞或突起与脑脊液接触。CSFCN在脑脊液与脑组织之间起着信息交流的作用。由一氧化氮合酶(NOS)神经元分泌产生的一氧化氮(NO)作为神经中枢的一种信息分子,可直接弥散到周围神经元,调节周围神经元递质的释放。有关自发性高血压大鼠(SHR)第三脑室NOS-CSFCN的文献报道较少。我们既往研究表明NOS与加压素(VP)、催产素(OT)在SD大鼠第三脑室的CSFCN内有共存现象。本实验在此基础上用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)组织化学方法,对SHR的第三脑室内NOS-CSFCN的分布及形态进行观察,并结合免疫组织化学技术对NOS与VP在第三脑室CSFCN内的共存进行了研究。1材料和方法1.1尾动脉收缩压测定选用同母SHR成鼠5只(中国科学院上海实验动物中心),鼠龄13周,体质量200～220g,SD大鼠5只(南京医科大学动物中心)作为对照,体质量220～240g,雌雄不拘,在相同环境下用正常饲料喂养。血压测量:室温20℃,2组大鼠在清醒状态下,于每日上午9时用尾筒法测定尾动脉收缩压,测3次,连续测1周,取平均值。结果用x−±sx-±s表示,SHR收缩压为(23.19±1.45)kPa,SD大鼠收缩压为(13.87±1.26)kPa。经t检验,P<0.05,可见SHR组血压明显高于正常对照组。1.2兔抗vp抗体NADPH-d(瑞士Roche公司);硝基四氮唑蓝(NBT)(美国Amresco公司);兔抗VP抗体(美国Chemicon公司);生物素标记羊抗兔IgG(美国Vector公司);浓缩型DAB试剂盒(北京中山生物技术有限公司)。1.3免疫组织反应tri能力常规灌注、取材将含第三脑室的组织块在恒冷箱中作冠状连续切片(厚20μm),分3组贴片:(1)NADPH-d组织化学染色组;(2)VP免疫组织化学染色组;(3)NADPH-d+VP双标染色组,即先行NADPH-d组织化学染色,再行VP免疫组织化学染色。染色:(1)与(3)组切片加入反应液37℃避光孵育60min。反应液的组成:0.1mol/L磷酸缓冲液(PB),pH8.0,含0.3%TritonX-100,0.6g/L硝基四氮唑蓝(NBT),0.5g/LNADPH-d,反应后用pH7.4的PBS充分漂洗。(2)与(3)组进行VP免疫组织化学反应:切片经正常羊血清(1∶50)处理30min,兔抗VP血清(1∶5000)4℃孵育12h,PBS漂洗,ABC免疫反应,二氨基联苯胺(DAB)溶液(0.05%∶0.01%)室温孵育约15min,PBS漂洗终止反应。对上述切片脱水封片,光镜观察,摄片,并在高倍镜下计数。实验结果用双标细胞数占所有单、双标阳性细胞总数的百分率来表示,两组间用U检验,P<0.05为有统计学差异。对照实验另取1只SD鼠脑冠状连续切片,分4套作对照实验。分别作以下实验,(1)抗体交叉实验:①空白实验:分别省去NADPH-d组织化学染色与VP免疫组织化学染色中的NADPH-d、兔抗VP血清,分别孵育切片;②置换实验:用正常兔血清代替VP免疫组织化学染色中的兔抗VP血清。(2)呈色混合实验:在NADPH-d组织化学染色程序结束后,切片经PBS漂洗,然后直接进行VP免疫组织化学染色程序中的DAB/H2O2呈色步骤,以证实在NADPH-d组织化学染色后是否有残余的NADPH-d、NBT与VP免疫组织化学染色程序中的DAB反应,从而导致反应产物混杂。以上实验结果阴性。2结果2.1nos-csfcn的分布按Swanson等命名自前向后依次为:视前区(MPA)、室旁核前大细胞亚核(amPVN)、室旁核内侧大细胞亚核(mmPVN)、室旁核后大细胞亚核(pmPVN)。上述4个平面2组大鼠的3V室壁均有NOS-CSFCN分布,且分布较为类似。自吻侧向尾侧,分布呈由腹侧部逐渐向背侧部过渡迁移的特征:在MPA水平主要分布在第三脑室室壁的腹侧部与底部;在amPVN水平第三脑室室壁的腹侧部与背侧部均有分布(附图A);在mmPVN水平,多密集排列于第三脑室室壁背侧或腹侧与背侧交界处;在pmPVN水平,主要分布在第三脑室室壁的背侧部(附图B)。另外,在Swanson等所描述的室旁核前小细胞部(PaAP)的第三脑室室管膜下层或室管膜内可见大量NOS-CSFCN呈现由吻侧向尾侧有逐渐增多的趋势,可达数层。NOS-CSFCN位于脑室室管膜内和室管膜下或距室管膜一定距离处,但有突起伸入脑室,与脑脊液相接触。NOS-CSFCN与室周核、室旁核(PVN)内NOS阳性神经元接触密切。2.2阴血特性及阳性细胞的结构及共存率在上述的平面范围,2组大鼠第三脑室周围也可见VP阳性CSFCN分布,VP-CSFCN在第三脑室的分布与NOS-CSFCN比较一致,形态也基本类似。双标记神经元细胞核及核周围的细胞质呈棕黄色,外周的细胞质与突起呈蓝褐色。两者的比例在各细胞间存有差异,可分3种类型:NOS反应优势型(NOS染色深,多数细胞体直径特别大,可达30μm以上);VP反应优势型(VP呈色深,细胞体直径小于前者,约20μm);两者均衡型(细胞体直径居两者之间)(附图C)。观察了5套双重反应切片,在MPA至pmPVN部位的第三脑室室壁所有反应阳性的CSFCN中,SD组阳性细胞总数为347个,VP-NOS双标神经元数为42个,占总阳性细胞数的12.1%。SHR组阳性细胞总数为333个;VP-NOS双标神经元数为77个,占总阳性细胞数的23.1%。两组大鼠共存率经U检验,P<0.01,说明SHR组共存率较SD组高。其中以amPVN、mmPVN双标神经元数最多,两种神经元共存率也最高。绝大部分阳性细胞的胞体较大,为大细胞型。其形态有卵圆形、圆形、梭形和多角形等。阳性细胞可嵌入室管膜细胞之间,一端较宽阔,与脑脊液接近,另一端变细,伸入周围的神经组织(附图D)。另有极少部分小细胞型NOS单标神经元,细胞体多呈梭形,位于室管膜内或室管膜下。3shr第三脑室csfcn与nos、vp的关系既往研究表明,CSFCN分泌的递质可以为经典递质(如5-HT)、肽能(如VP、P物质、胆囊收缩素)和氨基酸能(如GABA)递质。文献报道在室旁核(PVN)平面,第三脑室侧壁的室管膜上皮细胞之间,发现有个别VP阳性细胞,并可见有神经元突起与上皮细胞接触并伸入第三脑室腔内,认为VP神经元具有感受脑脊液变化或直接向脑脊液释放其分泌产物的功能。我们在对SHR第三脑室周围的CSFCN的研究中发现(1)SHR第三脑室周围的CSFCN与正常SD大鼠一样也具有分泌NOS和VP的功能;(2)本实验首次观察到在SHR第三脑室的CSFCN中NOS与VP两者具有共存性,且SHR组共存率较SD组高,提示中枢VP含量的异常增加可能与高血压发病有关;(3)SHR第三脑室的NOS、VP、NOS-VP3种阳性CSFCN与脑脊液、PVN内阳性细胞关系密切。在血压的调节方面,NO和VP之间存在一种平衡机制,该机制有待进一步研究。CSFCN与脑脊液的联系是通过非突触方式进行的,既有吸收脑脊液内物质又有分泌物进入脑脊液的功能,还可感受脑脊液压力及其内多种神经递质、细胞因子的变化,并将这些信息传给不同脑区。本研究发现位于SHR的PVN的NOS、NOS-VP阳性神经元有突起经室管膜突入第三脑室,提示SHR的这些神经元所产生的NO、VP也可直接释放入脑脊液,并将感受脑脊液各种物质的变化信息传给不同脑区。本实验阐明