老年猕猴桃下丘脑雌激素受体的表达特点

老年猕猴桃下丘脑雌激素受体的表达特点

20世纪90年代，相关的淑童醇及其产品存在于大脑中，并引入了神经类固醇的概念（baulieuandrobot，1992；jal.tal.，1999）。无论在动物早期的发育还是成年动物的可塑性上,类固醇激素均显示可以影响神经元的存活,神经轴突的生长和突触连接的形成(Garcia-Seguraetal.,1999)。动物实验初步表明,雌激素对各种脑损伤、神经系统的发育及功能等均有很好的保护作用,如雌激素等类固醇激素能提高脑创伤后的生存率,改善病人的神经功能(Phyllisetal.,2005)。因此,进一步深入研究其保护作用的机理有助于指导雌激素等类固醇在临床治疗上的应用,为脑保护的研究和治疗提供新的希望。神经内分泌系统在生命的各个时期对机体活动均有调节作用,其中以下丘脑—垂体—性腺轴与衰老的关系最为密切(马渊和张永祥,2002)。猕猴(Macacamulatta)与人类有着许多相近的进化功能关系,而猕猴的种属也较多,本研究选用猕猴川西亚种来比较老年猕猴下丘脑雌激素受体(estrogenreceptor,ER)表达及与青年猕猴的差别,旨在探讨雌激素在青年和老年猕猴下丘脑中作用差异的机制及意义,为临床上应用雌激素替代疗法治疗并预防和延缓老年神经退行性生理功能障碍等提供形态学理论依据。1材料和方法1.1放养经历种源与种源利用健康雌性青年猕猴4只(年龄7岁左右)、老年猕猴4只(年龄16～18岁,猕猴寿命一般为20～25岁),猕猴均未处于发情期,均有一胎以上繁育经历。由国家实验用猕猴种源基地(四川雅安)提供(动物使用许可证:SCXK(川):2005-105)。动物在昼夜交替的自然光周期下饲养,自由饮水进食。实验中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定(TheMinistryofScienceandTechnologyofthePeople’sRepublicofChina,2006)。1.2免疫组化er染色兔抗人ER单克隆抗体(武汉博士德生物有限公司),鼠抗兔链霉菌抗生物素蛋白一过氧化酶免疫组化超敏SABC试剂盒(福州迈新生物技术开发公司);Nikon50i-BF荧光生物数码显微镜(日本Nikon光学株式会社)。在符合动物权益法规的前提下,猕猴处理前禁食10h后,846麻醉,颈动脉放血处死(动物使用许可证:SCXK(川):2005-105)。剥脑,取出含下丘脑部位的脑区立即放入4%多聚甲醛磷酸缓冲液中固定12～24h,后移入含20%蔗糖的PB溶液中(4℃)直至组织块沉底。进行连续冠状冰冻切片,片厚20μm,切片隔2取2,分为2套,1套用于免疫组化ER染色,另一套大部分(约五分之四)用于常规组织学H.E染色进行核团定位,小部分(约五分之一)用于阴性控制试验。切片经0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min;切片在室温下用过氧化物酶阻断液孵育30min;切片入非免疫动物血清,室温下孵育30min;入兔抗人ER单克隆抗体(稀释浓度1∶200),4℃冰箱孵育72h。加生物素标记的二抗(生物素标记鼠抗兔ERIgG),室温下孵育1h;加链亲合素-过氧化物酶溶液,室温下孵育1h,在以上每一次孵育完成后均以0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min。孵育后入DAB显色液(配制:硫酸镍胺醋酸缓冲液50ml,DAB0.03g用双蒸水50ml溶解过滤,两液混合,加入葡萄糖0.2g,氯化铵0.04g,最后加入葡萄糖氧化酶0.001g)呈色,时间不超过30min,其间在镜下观察、掌握呈色时间。蒸馏水终止反应,0.01mol/LPBS液洗两遍,每次15s,进行贴片、晾干、脱水、透明和加拿大中性树胶封片。阴性控制试验以0.01mol/LPBS液(pH7.4)替代兔抗人ER单克隆抗体,其它步骤同上。1.3获取阳性细胞数目和粒度值核团解剖学位置定位参照Paxions.G的大鼠脑图谱定位(PaxinosandWatson,2006)。将制得的切片在光学显微镜下观察记录,Nikon数码显微镜拍照,用江苏捷达801形态分析软件,根据软件使用说明方法进行点选取,对阳性细胞进行数目和灰度值分析。数据处理采用的所有切片均为同一批次实验下的染色切片,且为漂片法染色,所有检测和统计均由同一人完成,确保在最大限度内保证染色背景颜色的均一性。每组动物每个核团选取5个典型切面进行阳性细胞的数目及灰度值测量(每只动物至少选取一张切片)。每个核团所有阳性细胞均计数,并且与灰度值测量一样,每张选取切片的每个核团均进行5次测量,后取其平均值作为本张切片该核团最终的数据。最后将5个典型核团切面所得数据写入Excel软件,应用t检验中双尾双样本等方差假设进行统计学处理,用均数±标准差(X¯¯¯±SD(X¯±SD)表示,P<0.05视为有统计学意义。2结果2.1er阳性产物在脑胶质瘤中的分布本试验用硫酸镍铵增强的免疫组织化学方法,阳性显色结果为蓝黑色,阴性控制实验切片未发现蓝黑色阳性产物出现。在青年组猕猴中可见ER在下丘脑中广泛分布。在下丘脑中ER阳性产物分布于许多核团中,在腹外侧核、腹内侧核、室周灰质、室旁核、弓状核等主要核团中都有广泛分布,在以上核团中阳性产物主要以胞核和胞浆染色为主,同时可看到阳性神经细胞的突起非常明显(图版Ⅰ—1,3)。在血管周围和第三脑室漏斗部周围核团中有较强的阳性物质表达并聚集成团簇状,而在其它区域中阳性物质在核团中均匀分布(图版Ⅰ—5,7)。2.2区、后区和腹外侧核阳性物质表达强度的比较ER在青年、老年猕猴下丘脑中的表达特点详见表1和图版Ⅰ—1～8。对比青年和老年猕猴,从表中的平均灰度值可以看出:下丘脑室周灰质和室旁核达到极显著差异(P<0.01),下丘脑前区、后区和腹外侧核中阳性物质的表达强度差异显著(P<0.05),而弓状核和腹内侧核等未见显著差异(P>0.05)。从表中阳性细胞数目可以看出:下丘脑腹内侧核、室周灰质、室旁核下丘脑前区、后区中阳性细胞数目差异极显著(P<0.01),下丘脑腹外侧核数目差异显著(P<0.05),弓状核差异不显著(P>0.05)。同时从整个下丘脑区的全切片观察,可以看出青年猕猴的下丘脑前区和下丘脑后区中阳性产物表达强度均显著强于老年猕猴(P<0.05),阳性细胞数目极显著高于老年猕猴(P<0.01),神经细胞的突起密度也明显高于老年猕猴。3相关研究的地质学研究目前,研究发现雌激素主要作用于生殖系统、中枢神经系统、心血管系统和骨组织等(Nabiletal.,2000;Bai,2008)。因此,雌激素是一种能调节机体多种生理功能的激素,且雌激素主要通过与雌激素受体(Estrogenreceptor,ER)结合发挥作用。已有研究发现ER在下丘脑中分布广泛,指出雌激素可直接作用于下丘脑,并影响其神经元的结构和功能(Simerlyetal.,1990;Blausteinetal.,1992;Milleretal.,1998;DufournyandWarembourg,1999)。本文发现ER在猕猴川西亚种下丘脑中多个主要核团内广泛存在,说明ER在对下丘脑生理作用的调控方面起着重要作用,这与以往在其他动物下丘脑中ER相关方面的研究成果(Simerlyetal.,1990;Blausteinetal.,1992;Milleretal.,1998;DufournyandWaremrourg,1999)基本一致。另外,雌激素在各种损伤后的神经保护作用中日益受到关注,大量的流行病学调查和动物实验提示,雌激素对各种脑损伤有保护作用。雌激素可通过保护脑血管的调节功能,调节一氧化氮形成、拮抗兴奋性毒性、抗调亡等多种机制发挥脑保护作用(Phyllisetal.,2005)。本实验发现在血管周围和第三脑室漏斗部周围核团中有较强的阳性物质表达并聚集成团簇状,而阳性物质在其它区域的核团中均匀分布,这种现象一方面表明了雌激素在对脑血管的保护和调节方面可能起着重要作用,另一方面外周血和脑脊液中的雌激素可从血管壁和脑室管腔脉络丛渗透出来,直接与高表达的ER结合,进而调控其周围邻近神经元细胞的功能,继而发挥雌激素的脑保护或神经再生调控作用。在机体衰老过程中,神经内分泌的失调是重要的生理现象之一。下丘脑作为神经内分泌的调节中枢,在这些衰老变化中起着十分重要的作用(Stemmelinetal.,2000)。同时,雌激素水平下降及免疫细胞中雌激素受体含量降低可能是更年期、老年期机体免疫功能衰退的原因之一(王文君等,1999;Grimaldi,2006)。据相关报道,患阿尔采默病(Alzheimer’sDisease,AD)的女性患者,用雌激素替代治疗后,AD发生率较未用者有明显降低,这可能与雌激素对大脑的神经保护作用有关,且雌激素在AD的神经保护作用、女性认知功能的改善方面也有较多的理论支持和临床基础研究(Wangetal.,2001)。本实验中观察到青年猕猴川西亚种下丘脑各个核团中ER表达量显著高于老年猕猴,提示一方面猕猴成年后随着年龄的增长,下丘脑ER蛋白表达水平随之降低,使得雌激素通过ER发挥功能产生蛋白水平上的形态学障碍,从而导致老年机