ar基因启动区c-606单甘酸多态性与2型糖尿病视网膜病变易感性的关系

ar基因启动区c-606单甘酸多态性与2型糖尿病视网膜病变易感性的关系

0糖代谢相关基因检测糖尿病视网膜病变（rp）是糖尿病微血管疾病（diason）的常染色体。根据近20年的研究，糖代谢中的多元醇转化与糖尿病微血管并发症有关，糖原酶（ar）是多元醇转化的加速酶。许多科学家认为，ar活性增加是糖尿病慢性并发症的原因之一。因此，ar基因是目前最受关注的候选基因之一。在过去的几年里，关于n核糖酸（c-1116t）的多态性和复合词的相关性研究很多。在当前的几年里，关于阿达曼基因5的多态性和mcp-s的相关研究很多。在当前的安因金基因启动区域（c-106t）中，单个甘酸多态性（spm）与dp的相关性开始受到关注。1对象和方法1.1两组患者临床参数的对比糖尿病按1985年WHO诊断标准,选择我院内分泌科住院和糖尿病门诊患者130例,均为重庆市汉族人,且相互之间无血缘关系.根据DM并发DMAP情况将130例患者分为两组:无微血管并发症组(NDC)组共76例,入选条件眼底荧光造影正常,尿白蛋白肌酐比率(Urinaryalbumincreatinineratio,UACR)<30μg·mg-1.DRP组:共54例,入选条件为眼底提示微血管瘤、出血斑或出血点、硬性或软性渗出灶,有的可见新生毛细血管,玻璃体出血等,UACR<30μg·mg-1.两组间临床参数构成无显著性差异(P>0.05,Tab1).1.2样品采集所有受检对象空腹采集静脉血,EDTA抗凝,分离白细胞提取DNA行基因多态性分析,另一管送检常规生化检测.1.3pcr扩增及扩增条件确定酚/氯仿法从外周静脉全血中提取的基因组DNA,PCR扩增AR基因上游启动区(nt-222to+41),引物序列如下:上游引物:5′-CCTTTCTGCCACGCGGGGCGCGGG-3′,下游引物:5′-CATGGCTGCTGCGCTCCCAG-3′.PCR反应条件参照文献方法进行.取纯化PCR产物10μL,加10×NEbuffer2μL,限制性内切酶BfaⅠ(NEWENGLANDBiolabs)10u,37℃2h.10μL酶切产物在30g·L-1琼脂糖凝胶中电泳,经溴化乙锭(EB)染色后,在紫外反射仪上观察结果.统计学处理:运用Hardy-Weinberg检验确认标本群体代表性是否符合Hardy-Weinberg平衡.基因计数各组基因型频率及等位基因频率,用四格表资料的χ2检验.2cc基因型的变化按Hardy-Weinberg定律,以NDC组和DRP组估算该基因在群体当中的遗传方式是否符合Hardy-Weinberg平衡,结果显示χ2值分别为0.755和2.68,两组P值均>0.05,认为符合Hardy-Weinberg平衡.野生型仅有一个BfaⅠ作用位点(-106),酶切后产生206bp和57bp两个片断即为CC基因型,-106碱基变异,T置换C后则产生另一个酶切位点,进一步将206bp片断酶切为147bp和59bp片断,如为纯合子变异则为TT基因型,如为杂合子则为CT基因型,酶切后共出现57,59,147,206bp4种片断.由此计数出(C-106T)等位基因和基因型分布频率,结果显示DRP中C等位基因和CC基因型显著增加,χ2=4.23和5.4,P<0.05两者差别有显著性(Tab2,3).3ar基因启动子序列在人类基因组DNA中存在大量的SNP,其多态性往往与相邻基因的调节和变异有关,因此,对其多态性的研究即为基因与疾病之间的相关性提供了线索.SNP是指基因组内特定核甘酸位置上存在两种不同的碱基,其中最少一种在群体中的频率≥1%.尽管遗传密码由4种碱基组成,但SNP通常只是一种二等位基因的或二态的遗传变异.SNP在CG序列上出现最为频繁,而且多是C→T,原因是CG中C即胞嘧啶常为甲基化的、自发地脱氨后即成胸腺嘧啶.本研究是运用PCR扩增AR基因启动子上游5′端nt-222to+41的区域,扩增片断为263bp,该片断(-165)含有一个限制性内切酶Bfa1的位点CTAG,当-106碱基变异,T置换C后则产生另一个酶切位点,这样由单一碱基变异形成了SNP,通过酶切后产生的不同产物计数出相应的基因型.结果显示130例2型糖尿病的样本中DRP组的C等位基因和CC基因型频率显然高于NDC组(P<0.05),提示AR基因转录起始点上游-106C→T置换与DRP关联.C等位基因和CC基因型可能是DRP的风险修饰因子.该区域的SNP与以往研究较多的2.1kb处(AC)n二核甘酸微卫星多态性不同的是(C-106T)紧邻AR基因编码区的侧翼调控区内,很可能参与调控基因的表达,对AR活性产生了具体的影响.Kao等在同一样本中分析AR基因(C-106T)SNP和(AC)n二核甘酸多态性与糖尿病视网膜病变关系的研究中发现两种多态性之间存在很强的连锁不平衡,也间接支持AR基因(C-106T)SNP可能是DRP的遗传标记.迄今为止,对AR基因与DRP的研究还仅限于多态性分析及相关性研究,至于AR基因是否存在碱基突变,与其SNP的关系尚不清楚,有待于今后研究工作的进一步深入.本方法在临床应用中可操