pld在主动致敏的rpmc脱颗粒过程中的作用

pld在主动致敏的rpmc脱颗粒过程中的作用

磷脂酶d（psd）广泛存在于动物和人类组织中，并被诱导产生主要底物的磷脂酸（p）。直接和间接产物磷酸（ph）、二脂肪甘氨酸（dag）和磷酸溶血（lpa）是重要的第二信息材料。此生命路径的链接地址：（05771.872001.051，fax：（05771.87217331，电子邮件：ybpharm*新闻信息，com。为是细胞信号转导的重要途径之一.但在短链伯醇(如乙醇,正丁醇等)存在的情况下,PLD优先催化PC与短链伯醇发生转磷脂酰基反应(transphosphatidylation)产生稳定的磷脂酰醇(phosphatidylalcohol)和水.许多研究利用此反应抑制PLD的生理功能.近年来的研究表明,PLD介导的信号转导途径是许多细胞胞吐过程中关键的一步.肥大细胞(mastcell,MC)是参与Ⅰ型变态反应的主要效应细胞,许多研究者试图通过修饰MC的生物学作用来缓和变态反应性炎症.MC激活后能分泌含预先合成及新合成的炎性介质的颗粒,这种胞吐作用对宿主防御及炎症发展过程中的组织损伤都起一定作用.但这种胞吐作用的具体机理不清.在对多种细胞包括大鼠嗜碱性白血病细胞株(RBL-2H3细胞)的研究中均发现这些细胞受各种因素激活引起的胞吐过程伴有PLD活性的明显升高,且PLD途径抑制剂可以完全或部分阻断这些细胞的胞吐作用.RBL-2H3细胞是模拟粘膜MC功能的细胞株,RBL-2H3细胞在被动致敏后受抗原攻击或非致敏情况下受钙离子载体等作用,可发生脱颗粒,且PLD的激活参与这一过程.这些结果均来自离体细胞实验,但对更能反映变态反应性疾病的整体和主动致敏时,PLD与MC脱颗粒的关系研究,未见报道.本实验采用主动致敏的大鼠腹腔肥大细胞(ratperitonealmastcell,RPMC)为实验材料,检测致敏RPMC在抗原攻击前后的PLD活性与脱颗粒程度及PLD抑制剂对RPMC的PLD活性与脱颗粒的影响,并探讨PLD在MC脱颗粒过程中所起的作用及经典平喘药沙丁胺醇(salbutamol),色甘酸钠(sodiumcromoglicate)对其影响.试图寻找抗变态反应药物新的作用靶点.1材料和方法1.1药物、试剂和仪器Sprague-Dawley(SD)大鼠,110只,♀♂各半,体重(170±20)g(x¯±s)(170±20)g(x¯±s),由浙江省实验动物中心提供.PC(C10∶0),油酸钠,氯化胆碱,胆碱氧化酶,二甲亚砜,正丁醇,2,3-二磷酸甘油酸(2,3-disphosphoglycerate,2,3-DPG),wortmannin,色甘酸钠,卵白蛋白(V级),对硝基酚-N-乙酰-β-D-葡糖胺均购自Sigma公司;硫酸沙丁胺醇,江苏金坛制药厂,批号971214;HEPES,鲁米诺(luminol),德国Merck公司;Percoll,瑞典Pharmacia公司;死百日咳杆菌,中国科学院上海生物制品研究所;辣根过氧化物酶,上海丽珠东风生物制品有限公司;其他试剂均为进口或国产分析纯产品.LXJ-04型离心机,上海医用分析仪器厂;TGL-16G台式高速冷冻离心机,上海安亭;SHZ-88台式水浴恒温振荡器,江苏太仓;二氧化碳培养箱,FormaScientific公司;DG3022A型酶联免疫检测仪,国营华东电子管厂;智能化微弱发光测量仪,中国科学院生物物理研究所.1.2细胞培养和活性检测实验共21批次,每批5~6只大鼠,RPMC经分离,纯化后,悬于改良Tyrode液[(Tyrode,HEPES明胶缓冲液,简称THG)mmol·L-1:氯化钠137,氯化钾2.7,葡萄糖5.6,氯化钙1,氯化镁1,HEPES10,明胶1g·L-1,以氢氧化钠调节pH至7.4]中,细胞终浓度为每升2×109,每批可得样本5~7个.各管细胞置37℃水浴温育5min后,加入等体积的药物或THG与细胞共育10min,然后以终浓度为4mg·L-1的卵白蛋白攻击120s.对照管以THG代替卵白蛋白攻击.最后,各管均加入等体积冰冷的THG,置冰浴终止反应,4℃离心(200×g,10min),上清用于检测脱颗粒反应,细胞用于检测PLD活性.所用药物终浓度:正丁醇0.1%,1%,2,3-DPG10mmol·L-1,wortmannin300nmol·L-1,色甘酸钠1,10μmol·L-1,硫酸沙丁胺醇1,10μmol·L-1.1.3大鼠细胞ca2+tlp扩增每只大鼠于脚掌sc2mg卵白蛋白(悬于10%新鲜制备的氢氧化铝凝胶),后腿im佐剂灭活百日咳杆菌2×1010.3周后,大鼠股动脉放血处死,ip无Ca2+,Mg2+的THG30mL(临用前加肝素5kU·L-1),轻揉大鼠腹部约90s,打开腹腔,用吸管吸取灌洗液(明显血性者弃用),将灌洗液于4℃离心(200×g,10min),沉淀以1mL无Ca2+,Mg2+THG重悬.取90%Percoll(9mLPercoll加1mL10倍浓度无Ca2+,Mg2+THG)4mL加入上述1mL细胞悬液,充分摇匀后,于液面上轻轻滴加1mL无Ca2+,Mg2+THG,4℃离心(200×g,10min),取管底细胞,以无Ca2+,Mg2+THG洗3次,沉淀以1mL含Ca2+,Mg2+THG重悬.细胞计数约每鼠5×105~9×105,以中性红作滴片染色(MC特异性染色)后,光镜下观察,细胞纯度95%以上,台盼蓝拒染活细胞95%以上.1.4ca2+,mg2+tlp表达治疗co-1、me2+3,mda的制备.反应总体积250μL,细胞终浓度每升2×109,各管细胞先置37℃水浴温育5min,然后以卵白蛋白(4mg·L-1)攻击120s,对照管(即自发释放管)以THG代替抗原,并设总量管(即将细胞充分裂解使胞内β-氨基己糖苷酶全部释放).加入250μL冰冷无Ca2+,Mg2+THG后置冰浴终止反应.4℃离心(200×g,10min),总量管取细胞悬液20μL,其余各管取上清20μL置96孔板,各孔加入0.4%TritonX-10010μL,4mmol·L-1对硝基酚-N-乙酰-β-D-葡糖胺60μL,置二氧化碳培养箱37℃温育2h后,各孔加入200mmol·L-1甘氨酸缓冲液(pH10.7)120μL终止反应并显色.在酶联免疫检测仪上410nm处检测,以空白管(THG20μL,0.4%TritonX-10010μL,4mmol·L-1对硝基酚-N-乙酰-β-D-葡糖胺60μL,200mmol·L-1甘氨酸缓冲液120μL)调零,读取各管吸光度A值.计算式:自发释放率%=对照管A值/总量管A值×100%;每管净释放率%=(每管A值-对照管A值)/(总量管A值-对照管A值)×100%1.5细胞培养液h7.4,5.1%tri能力取前述脱颗粒反应后离心得到的细胞,悬于100μL裂解缓冲液中(pH7.4,50mmol·L-1HEPES,0.1%TritonX-100),于振荡器上充分振摇后置于冰浴10min,然后将裂解液于4℃离心(200×g,10min)去除核及未破碎的细胞.1.6样品的制备与标准曲线的制定PLD水解PC产生的胆碱经胆碱氧化酶催化生成甜菜碱和过氧化氢(H2O2),再利用化学发光法测定生成的H2O2.即H2O2在过氧化物酶的作用下能将其所携带的能量传递给冷光剂鲁米诺,使鲁米诺处于激发态,当激发态的鲁米诺退到基态时,会产生波长为425nm的化学发光,其发光强度采用微弱发光测量仪检测.360μL的酶反应体系中含终浓度为22mmol·L-1HEPES(pH7.4),5mmol·L-1MgCl2,2mmol·L-1PC,6mmol·L-1油酸钠,100μmol·L-1CaCl2,加入90μL酶液启动反应(对照以相同体积的裂解缓冲液取代).反应在Eppendorf管中进行,37℃水浴振荡温育60min后,立即将Eppendorf管置于沸水浴中10min终止反应.待反应管冷却后,每管加入等体积的氯仿充分摇匀后,离心(4000×g,10min),吸取水相300μL作为发光检测的样品.500μL的发光检测体系中含终浓度为200mmol·L-1磷酸盐缓冲液(pH8.6),20μmol·L-1鲁米诺,胆碱氧化酶1U,过氧化物酶5U,加入待测样品或标准胆碱5μL启动反应,观察并记录发光峰值.胆碱标准曲线的制定:在发光检测体系中加入5~100pmol·L-1标准胆碱,利用发光峰值与胆碱浓度之间的线性关系,以发光峰值来计算待测样品中的胆碱浓度.在每次发光检测前,以14C作为标准光源校正微弱发光测量仪,并制定标准曲线.1.7统计处理统计数据用x¯±sx¯±s表示.采用SigmaStat统计软件包,多组间比较用one-wayANOVA和Dunnett法检验.2结果2.1-氨基己糖苷酶释放活性测定,正丁醇的普通法产品抑制当以卵白蛋白(4mg·L-1)攻击致敏RPMC120s后,致敏RPMC(106)的PLD活性由对照组的(62±14)pmol·min-1(n=6)升高至(151±19)pmol·min-1(n=7),β-氨基己糖苷酶释放率是自发释放率的8.3倍(n=8,p<0.05).以0.1%正丁醇处理致敏RPMC后,再以卵白蛋白(4mg·L-1)攻击,106细胞PLD活性为(76±11)pmol·min-1(n=6)与对照组细胞PLD活性相近,而细胞β-氨基己糖苷酶释放率虽比抗原攻击组有显著降低,但未下降到对照组水平.与0.1%正丁醇组相比,1%正丁醇完全取消抗原引起PLD激活,且能明显降低细胞受抗原攻击后的β-氨基己糖苷酶释放率使其接近对照组水平,与对照组比较无显著差别.这些结果表明,1%正丁醇对致敏RPMC受抗原攻击后的β-氨基己糖苷酶释放的抑制作用比0.1%正丁醇的作用强.PLD的竞争性抑制剂2,3-DPG在10mmol·L-1时不但能明显抑制致敏RPMC受抗原攻击后PLD活性的增加,且使细胞β-氨基己糖苷酶释放率降低到对照水平.PLD的上游抑制剂wortmannin,为磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3-K)抑制剂,wortmannin(300nmol·L-1)能使PLD活性降低至接近对照组水平,但仅部分抑制细胞β-氨基己糖苷酶释放.比较0.1%,1%正丁醇,10mmol·L-12,3-DPG,300nmol·L-1wortmannin对RPMC的PLD活性及β-氨基己糖苷酶释放率的影响,发现这些药物均能明显抑制PLD活性,但10mmol·L-12,3-DPG抑制细胞β-氨基己糖苷酶释放的作用比其他两药强(表1).Ratperitonealmastcellwasprewarmed37℃for5min.Then,mastcellwastreatedrespectivelywith1-butanol(0.1%,1%),2,3-disphosphoglycerate(2,3-DPG,10mmol·L-1)orwortmannin(300nmol·L-1)for10minbeforechallengedbyovalbumin(4mg·L−1)for120s.x¯±s,an=7.∗P<0.05L-1)for120s.x¯±s,an=7.*Ρ<0.05,comparedwithcontrolgroup;#P<0.05,comparedwithovalbumingroup;△P<0.05,comparedwith0.1%butanolgroup.Activelysensitizedratperitonealmastcellwasincubated37℃for5min,beforetreatmentofmastcellwithSal(1,10μmol·L-1)orSC(1,10μmol·L-1)for10min.Then,cellswerechallengedwithovalbumin(4mg·L−1)for120s.x¯±s,an=6.∗P<0.05L-1)for120s.x¯±s,an=6.*Ρ<0.05,comparedwithcontrolgroup;#P<0.05,comparedwithovalbumingroup.2.2降低细胞pld活性与直接接触抗原组[106细胞,PLD活性(162±33)pmol·min-1,n=13]相比,10μmol·L-1沙丁胺醇可降低细胞PLD活性至(135±29)pmol·min-1(n=6,P<0.05),但仍比不接触抗原组的PLD活性(65±11)pmol·min-1高(n=6,P<0.05);10μmol·L-1沙丁胺醇可降低细胞β-氨基己糖苷酶释放,但仍高于不接触抗原组的自发释放率.表明1,10μmol·L-1沙丁胺醇均只能部分抑制细胞PLD活性与细胞β-氨基己糖苷酶释放(表2).2.3色甘酸钠对出现-氨基己糖苷酶的影响1,10μmol·L-1色甘酸钠均能部分抑制PLD活性与细胞β-氨基己糖苷酶释放,与直接接触抗原组相比,两种浓度的色甘酸钠使抗原诱导的PLD激活与细胞β-氨基己糖苷酶释放明显下降(表2).3pld抑制剂的筛选MC脱颗粒是MC表现其生物效应的主要事件,但MC的脱颗粒机理仍待阐明.越来越多的研究者提出PLD激活可能是调节MC脱颗粒的机理之一.Ishimoto等报道钙离子载体ionomycin诱导RPMC的组胺和花生四烯酸释放的50%以上可被乙醇抑制,前列腺素D2的释放被乙醇完全抑制.对MC功能模拟细胞株RBL-2H3细胞的研究表明,PLD激活是IgE受体介导的被动致敏RBL-2H3细胞释放组胺和花生四烯酸的关键一步.然而,Mizuno等报道蜂毒引起的RBL-2H3细胞释放组胺与PLD激活无关,表明PLD激活在MC脱颗粒中的作用并未肯定.而且RBL-2H3并不能完全代表MC来说明其生物学行为,关于PLD是否参与主动致敏的MC脱颗粒过程,尚未见报道.本研究组曾研究不同抗原量攻击对主动致敏RPMC脱颗粒与PLD活性的时相和量效变化,发现RPMC脱颗粒过程中伴有PLD活性显著升高,且PLD激活是RPMC脱颗粒过程中的原发作用(待发表).为进一步探讨PLD激活与主动致敏MC脱颗粒之间可能存在的联系,本实验使用了两种PLD抑制剂.正丁醇通过转磷脂酰基反应抑制PLD的生理产物PA的生成.结果发现(0.1%,1%)的正丁醇均能抑制主动致敏MC脱颗粒及相伴随的PLD活性的升高.2,3-DPG是PLD的竞争性抑制剂,由于2,3-DPG和正丁醇的作用机理不同,故使用两者后所得的结果可以互补.有文献报道2,3-DPG有以下特点:①作为PLD的竞争性抑制剂是确定的;②对细胞低毒;③不抑制PI-PLC的活性.另外,2,3-DPG能剂量依赖(2.5~10mmol·L-1)地抑制与PLD相联系的NK细胞,腹腔中性粒细胞的脱颗粒.本文采用10mmol·L-1的2,3-DPG不但抑制了主动致敏MC的PLD活性,而且完全抑制了细胞β-氨基