g蛋白激活内侧流变型钾通道的研究进展

g蛋白激活内侧流变型钾通道的研究进展

g蛋白激活的内东正教钾通道（gilk或kir3）是k-k超家族中七个成员中的代表性家族。现在已知道Kir家族有五个成员(GIRK1-5),GIRK是目前已知的唯一直接与Gβγ结合而被激活的离子通道。最初发现的GIRK是心脏的毒蕈硷K+通道(KAch),Ach与毒蕈碱M2受体结合后,通过激活对百日咳毒素(PTX)敏感性G蛋白而激活KAch出现负性变时效应,从而降低心率。后来发现GIRK亚单位在脑中广泛分布,很多神经递质如γ-氨基丁酸(GABA)、阿片、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)等通过激活PTX敏感性G-蛋白而激活GIRK,GIRK通过慢突触后抑制性电流而调节神经元的兴奋性。1吉克斯的分子基础1.1牛心脏和dirk3中的同源性四聚体GIRK家族共有五个成员(GIRK1～GIRK5),GIRK通道为四聚体,一般认为正常GIRK通道是GIRK1与GIRK2,GIRK3和GIRK4中的一种形成的异源性四聚体,而GIRK1自身不能形成有功能性的通道。但近来又有研究证明在牛心脏中存在GIRK4的同源性四聚体;Tanya证明在脑中的一些区域中确实存由GIRK2和GIRK3亚基组成的异源性多聚体GIRK通道。因此,也可能存在非GIRK1的同源性或异源性四聚体。1.2氨基酸序列及信号肽GIRK各亚基的长度在393和501个氨基酸之间,如人类的四个亚基GIRK1至GIRK4的氨基酸数目分别是:501,423,393,419。哺乳动物的GIRK各亚基的氨基酸排列循序都已清楚,每一种GIRK亚基在各物种之间的同源性通常超过90%。人和大鼠的GIRK1有99%的氨基酸序列是相同的。GIRK各亚基之间氨基酸同源性在60%至80%之间,变化最大的氨基端前40个氨基酸和360位氨基酸以后的羧基端。所有内向整流型K+通道的亚基都有一个相同的结构模式,其特征是有两个跨膜区域M1,M2和一个与电压依赖性K+通道相似的孔形成区域(P或H5)以及胞浆侧的N-端和C-端。GIRK的结构轮廓主要是根据其疏水性区域得出的,以下的研究结果也支持这种摧测:在N-端缺乏一个信号肽;各种KirC-端富有的蛋白激酶A(PKA)磷酸化位点,如在GIRK1为193位苏氨酸和497位丝氨酸;几种Kir如Kir2.2和Kir2.3的羧基最末端有一致序列ES/Tx/I,人类GIRK2,GIRK3能结合到含有PDZ结构域的蛋白质,如PSD95;以上都是细胞内定位的提示序列。细胞外定位的提示序列,如N-端糖基化位点是在M1和P连接部分,例如在GIRK1为119位天冬酰胺。1.3rgs蛋白抑制剂当激动剂与含有7个α-螺旋的跨膜受体结合后,受体激动G蛋白,GTP与Gα亚基结合,同时Gβγ与Gα-GTP解离,Gβγ直接激活GIRK导致通道开放。随后,具有GTP酶活性的Gα水解GTP,Gβγ再与Gα-GDP结合导致GIRK的失活。这一系列反应被认为是许多Gi/Go偶联型神经递质激活GIRK主要通路,研究发现与百日咳毒素(PTX)敏感性G蛋白Gi/Go偶联的受体似乎都可激活GIRK。GIRK的激活不需要细胞内的第二信使参与,但GIRK受细胞内的ATP、Mg2+、磷酯酰肌醇-4,5-二磷酸、磷酸化及机械张力的调节。细胞内的ATP和Na+也能够影响GIRK通道的基础电流。近来研究发现RGS蛋白对正常体内GIRK通道的失活起着重要作用。虽然对GIRK的信号转导通路和调节进行了大量研究,但GIRK的详细门控机制及调节还不很清楚。2病理组织学检测自GIRK各亚基cDNA被克隆后,应用原位杂交对GIRK各亚单位的mRNA在大鼠和小鼠脑中的分布进行了广泛的研究。研究发现GIRK1-3各亚基在脑中广泛分布,如在海马、新皮层、嗅系统、间脑、小脑中含量都很丰富。GIRK4只分布在少数脑区,研究发现GIRK4在小鼠脑区的分布如下:皮层深部的锥体神经元,内侧梨状层的核团、脑岛皮层的屏状核、下丘脑腹内侧核、椎状束旁核、下丘脑室旁核和脑干的核团(下橄榄核、前庭核)。而在大鼠则主要分布于小脑颗粒细胞层、上丘、外侧隔核、海马CA3区锥体神经元。应用免疫组化对GIRK1和GIRK2在脑中的分布进行研究,发现GIRK1和GIRK2在脑中的某些区域有交叉分布,并且GIRK1和GIRK2在脑中各区域的分布与GIRK1mRNA和GIRK2mRNA在脑中的分布基本一致。如在大脑皮层、海马、外侧隔核和小脑均有丰富的GIRK1和GIRK2;但在下丘脑、蓝斑和迈特氏基底核两者的含量均很低。GIRK通道主要存在于神经元的胞体和树突的突触后膜上,也存在于轴突的突触前膜上。研究发现,在大鼠海马CA1区域的神经元GIRK1主要存在于树突、树突棘和胞体。Ken发现在下丘脑室旁核下丘脑室旁核(PVN)的神经元胞体没有免疫反应,而在神经纤维末梢的曲张体有染色,进一步研究发现GIRK1在神经纤维末梢终扣处免疫反应明显,而在树突没有免疫反应。这种免疫反应方式证明在PVN中GIRK1存在于突触前而不是突触后。看来,不同脑区和不同的神经元,GIRK存在的亚细胞部位也不一样。3吉克斯特中枢神经系统的生理影响3.1irk电流的作用尽管GIRK具有内向整流作用,但它们通常的生理作用是在接近静息膜电位水平上允许K+外流。在静息电位和引起神经元产生动作电位的膜电位之间这种外向的GIRK电流非常重要,这种超极化的K+电流可降低细胞的兴奋性,在中枢神经系统,主要是调节突触后神经元的兴奋性。将GIRK1,GIRK2,GIRK4和5-HT1A受体共转染培养的海马神经元,在给予5-HT后发现由于GIRK的激活而使神经元兴奋的阈值增加了2～3倍,最终抑制神经元的放电频率。目前认为GIRK调节神经元的兴奋性主要是减少神经元峰电位的频率,通过产生慢抑制性突触后电位抑制神经元的兴奋性。GIRK是否参与静息电位的形成还待进一步研究。3.2irk1mrna的神经元/传导束GIRK在脑中可能通过突触前抑制调节神经递质的释放。研究发现在下丘脑室旁核(PVN)GIRK1蛋白存在于突触前而不在突触后,投射到PVN的神经元位于下丘脑、边缘系统和脑干的几个神经核团(如中缝背核、臂旁核),原位杂交证明GIRK1mRNA存在于这些神经元中,并且这些神经元中含有DA,NA和NY等神经递质。在神经元和异源性细胞中均已证明DA,NA和NY的受体和GIRK通道相偶联。因而,GIRK可能通过这些神经递质的受体调节PVN中催产素、血管加压素和其它神经肽的释放。应用原位杂交和免疫组化的双标技术发现在视上核100%的催产素阳性神经元有GIRK1-3的mRNA表达,95%的加压素阳性神经元有GIRK1-3的mRNA表达。因此,也有可能是通过GIRK通道调节这两种神经元的催产素和加压素的释放。一般认为在神经纤维末梢通过抑制电压依赖性钙通道(VDCC)可抑制神经递质的释放。近来研究发现GABA和NE都能抑制VDCC而激活GIRK,因而GIRK在中枢神经系统中调节神经递质的释放作用值得深入研究。4dirk通道weaver小鼠是一种遗传性神经生理功能紊乱的小鼠,它有许多缺陷:共济失调、运动过多、震颤、癫痫发作及雄性不育,其病理特征是小脑颗粒细胞和黑质多巴胺能神经元的变性。有研究发现造成这些症状的原因是GIRK2基因(位于16号染色体)的一个碱基发生了点突变(Gly→Ser),并且突变发生在K+的选择性序列Gly-Tyr-Gly。在爪蟾卵细胞中突变的GIRK2(GIRK2mv)通道成为一个对K+,Na+,Ca2+均能通透的非特异性阳离子通道,此外由GIRK2mv和GIRK1组成的异源性多聚体通道在体外表达系统中功能也减退。在神经元内,这种通道不能被神经递质激活形成正常的GIRK电流而使神经元产生慢性去极化,并且可能引起神经元死亡。Stefano等做成GIRK2基因敲除的小鼠(GIRK2-/-小鼠),GIRK2-/-小鼠与Weaver小鼠不同,它的小脑中除不含GIRK2和GIRK1减少外,小脑的形态正常;中脑黑质DA神经元和其树突除不含GIRK2蛋白外形态也正常。这就提示weaver小鼠的异常表现是由于GIRK2的功能异常而不是因缺少GIRK2所致,突变的GIRK2导致了发育的异常。研究还发现GIRK2-/-小鼠表现为多种形式的间歇性癫痫发作,并且发作可被环境因素和药物PTZ诱发。Paul等比较了正常小鼠、weaver小鼠和GIRK2基因敲除小鼠的小脑颗粒细胞的GIRK电流,发现weaver小鼠和GIRK2基因敲除小鼠的GAB