氨基糖苷类药物联合其他抗鲍曼不动杆菌药物对鲍曼不动杆菌耐药突变选择窗的影响

氨基糖苷类药物联合其他抗鲍曼不动杆菌药物对鲍曼不动杆菌耐药突变选择窗的影响

博曼运动杆菌是医院常见的感染病原体。多所临床检测机构结果证实,因其固有耐药特性及抗菌药物的选择性压力,导致鲍曼不动杆菌对多种抗菌药物耐药。耐药突变选择窗(MSW)理论的提出,为解决临床细菌耐药提供了一条新的途径。该理论认为,如果抗菌药物的浓度高于防突变浓度(mutantpreventionconcentration,MPC),可同时杀灭敏感菌和突变的耐药菌,不易出现耐药;低于MIC时无杀菌作用也不会出现耐药;而药物浓度位于MSW(MIC~MPC)内,可选择出突变耐药株。MSW越宽,细菌发生耐药突变的机会越高,这种突变选择能力可用选择指数(selectiveindex,SI=MPC/MIC)表示。但是临床常规治疗鲍曼不动杆菌的MPC都超过了药物的血浆高峰浓度,应用这样高的药物浓度将增加药物的不良反应,因此临床上用药的剂量不可能达到MPC浓度。MSW理论认为,当2种不同作用机制的抗菌药物联合应用时,细菌需对2种药物同时产生耐药突变才能生长,此时突变概率为10-14,而人体感染细菌时的浓度最高达109~1010,因此对2种药物同时耐药的细菌浓度为10-5~10-4,人感染如此低浓度的细菌不可能致病。因此联合用药从理论上可关闭MSW,有效控制细菌耐药。选择4种临床常用的抗鲍曼不动杆菌药物,分别与3种氨基糖苷类药物联合应用,观察联合用药能否有效降低单药应用时的MPC、缩小MSW,从而减少耐药菌的产生。材料和方法一、材料表面(一)试验中的细菌(二)微生物鉴定系统MH琼脂、MH肉汤(OXOID,瑞典);VITEK微生物鉴定系统(生物梅里埃,法国);电热恒温培养箱(上海精实);比浊仪(梅里埃,法国));E试验测试条(ABBiodisk,瑞典)。(三)妥布素ud-ue头孢哌酮-舒巴坦(1g/瓶,辉瑞)、亚胺培南-西司他丁(1g/瓶,默沙东)、环丙沙星(0.2g/100mL,拜耳)、左氧氟沙星(100mg/2mL,扬子江)、阿米卡星(100mg/2mL,禾丰制药),妥布霉素(40mg/1mL,新华制药),奈替米星(100mg/100mL,三爱药业)。三、方法(一)单药mic的测定应用每种抗菌药物的E试验条分别测定上述抗菌药物在体外对鲍曼不动杆菌ATCC19606的MIC。(二)原液的配制和稀释配制亚胺培南-西司他丁、头孢哌酮-舒巴坦原液时,从无菌生理盐水250mL中抽取5mL溶解药粉,再与剩余盐水混合,配制成终浓度为4000mg/L的原液,然后分别稀释成不同浓度。精密量取1mL的环丙沙星(2000mg/L)、左氧氟沙星(50000mg/L)、阿米卡星(50000mg/L)、妥布霉素(40000mg/L)、奈替米星(1000mg/L)原液,分别依次加入不等量的无菌生理盐水,配制成不同浓度的药物溶液。(三)亚胺培南-西司他丁药物的配制以亚胺培南-西司他丁琼脂平皿制备为例,精密秤量不同浓度的亚胺培南-西司他丁2mL,置入18cm的无菌平皿,再加入MH琼脂18mL,边加边混匀,配制成亚胺培南-西司他丁终浓度分别为0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/L的药物琼脂平皿。(四)亚胺培南-西司他丁和阿米卡星的mic浓度的配置以亚胺培南-西司他丁联合阿米卡星琼脂平皿为例说明。亚胺培南-西司他丁在琼脂平皿上的浓度分别为1/4MIC、1/2MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC和16MIC浓度(MIC为体外亚胺培南-西司他丁对鲍曼不动杆菌ATCC19606的MIC),3种氨基糖苷类药物在琼脂平皿上的浓度均为其对鲍曼不动杆菌ATCC19606的MIC浓度。以配置1/4MIC浓度亚胺培南-西司他丁和1MIC浓度阿米卡星的药物琼脂平皿为例介绍具体方法。首先以4000mg/L的亚胺培南-西司他丁原液为基础,加入一定量的无菌生理盐水,配制成20倍1/4MIC浓度的亚胺培南-西司他丁溶液,同时制备20倍阿米卡星对鲍曼不动杆菌ATCC19606MIC浓度的溶液。分别取上述配制好的抗菌药物溶液各1mL,置入18cm的无菌平皿中,混匀。再加入MH琼脂18mL,边加边混匀,配制成终浓度为1/4MIC亚胺培南-西司他丁和1MIC阿米卡星的药物琼脂平皿,其他联合药物琼脂平皿均按此方法配制。(五)最低药物浓度测定挑取单个菌落接种于MH肉汤200mL中震荡过夜培养,离心后,再悬浮在MH肉汤200mL中,震荡培养6h,菌液浓度可达(6~9)×109CFU/mL,3000r/min,相对离心力2860×g离心后富集,用无菌吸量管准确吸取9mL上清液,使菌液浓度富集为(6~9)×1010CFU/mL,将菌液浓度用生理盐水稀释,同时利用比浊仪将菌液浓度调整为3×1010CFU/mL。取100μL菌液均匀涂抹在含有抗菌药物的MH平皿上,每个浓度4个平皿,使每个含药平皿的细菌接种量为1.2×1010CFU(注:1mL菌液浓度为3×1010CFU,因此100μL的菌液浓度为3×109CFU,4个平皿总浓度为3×4×3×109CFU,即1.2×1010CFU)。37℃孵育,观察24、48、72h时的菌落生长情况,以72h无菌落生长的最低药物浓度为MPC。对接近MPC药物浓度筛选出来菌株接种无药物的MH平皿,传代2次后再接种于原筛选药物浓度的平皿上,以确保其是耐药突变株。一、亚胺培南-西司他丁/左氧氟沙星l4种抗菌药物对鲍曼不动杆菌ATCC19606的MIC分别为:头孢哌酮-舒巴坦0.25mg/L,亚胺培南-西司他丁0.25mg/L,环丙沙星1.0mg/L,左氧氟沙星1.0mg/L。3种氨基糖苷类药物对鲍曼不动杆菌ATCC19606的MIC分别为:阿米卡星4.0mg/L,妥布霉素2mg/L,奈替米星4.0mg/L。二、单药立体成像和si4种抗菌药物单药对鲍曼不动杆菌ATCC19606的MPC、SI见表1三、氨基糖苷类抗生素4种抗鲍曼不动杆菌药物联合3种氨基糖苷类药物后,各自MPC、SI见表2。鲍曼不动杆菌由于多种耐药机制的参与往往导致其对多种抗菌药物耐药,致使临床治疗失败率较高。中国CHINET细菌耐药监测资料显示,鲍曼不动杆菌对头孢菌素类、喹诺酮类、碳青霉烯类抗菌药物的整体耐药水平较高。MSW理论的提出为控制细菌耐药指出一条新的途径。MSW理论对传统的基于MIC理论的给药方案提出了质疑与挑战,为控制细菌耐药提供了2条途径:其一是超过MPC浓度给药,但某些药物的MPC较高,一般是其MIC的16~32倍,应用如此高的浓度可能导致严重的不良反应;其二是缩小MSW,联合用药可能是缩小MSW的最佳方法。Zhanel等发现左氧氟沙星联合头孢他啶、哌拉西林-他唑巴坦、美罗培南、多黏菌素均可使左氧氟沙星对铜绿假单胞菌的MPC/MIC明显降低。李朝霞等发现联合应用左氧氟沙星可以缩小万古霉素对金葡菌耐药MSW,减少耐药突变株产生。氨基糖苷类抗生素属静止期杀菌药,杀菌作用呈浓度依赖性,尤其对需氧革兰阴性杆菌作用较强,而且具有明显的抗生素后效应。目前临床应用的氨基糖苷类抗生素主要有庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、依替米星及奈替米星等。但由于氨基糖苷类抗生素具有耳毒性、肾毒性及神经-肌肉阻滞等不良反应,导致临床医师用药前顾虑较多,往往不作为首选用药。但氨基糖苷类抗生素对鲍曼不动杆菌有较好的抗菌作用,2011年CHINET耐药监测资料显示:在所有监测的抗菌药物中,鲍曼不动杆菌对阿米卡星的耐药率为48.7%,远低于亚胺培南-西司他丁、美罗培南、左氧氟沙星、环丙沙星等抗菌药物。本试验应用临床常用的4种抗鲍曼不动杆菌药物,分别联合3种氨基糖苷类药物,试验结果表明,上述抗菌药物单独应用时,对鲍曼不动杆菌ATCC19606的MSW较宽,尤其是头孢哌酮-舒巴坦、亚胺培南-西司他丁,其SI均大于32,根据MSW理论,以上4种抗菌药物单独应用易选择出耐药突变体。而4种抗菌药物联合3种氨基糖苷类抗生素后,其耐药MSW均有明显缩小,其中联合阿米卡星后,4种抗菌药物的SI下降最为明显。联合妥布霉素及奈替米星,SI下降虽不如联合阿米卡星明显,但较单药应用时有明显下降,可以有效控制耐药突变株的产生。同时该试验选择的3种氨基糖苷类药物与其他抗菌药物联用时的浓度均为体外测得的其对鲍曼不动杆菌ATCC19606的MIC,分别为阿米卡星4.0mg/L;妥布霉素2.0mg/L;奈替米星4.0mg/L。临床上3种抗菌药物应用时,常规剂量完