膈下迷走神经对大鼠消化道内fos表达的影响

膈下迷走神经对大鼠消化道内fos表达的影响

近年来的研究表明，迷走神经在促进免疫信息向脑的转化中可能发挥着重要作用。既往国内外在研究迷走神经向脑传递免疫信息的作用时,多采用细胞因子、内毒素、肠毒素等免疫刺激剂经腹腔或静脉内给药,以非自然感染的方式免疫动物。本实验采用消化道内给予鼠伤寒杆菌的方式,以更真实地再现动物在自然条件下接受抗原刺激的状态,反映迷走神经在动物自然感染状态下所发挥的免疫信息传递作用。鼠伤寒杆菌(STM)属B群沙门菌,对人和动物皆可致病,由胃肠道途径感染,可以引起局部的或全身的感染。本实验通过切断膈下迷走神经观察鼠伤寒杆菌刺激后下丘脑室旁核(PVN)和视上核(SON)的Fos表达变化,进一步探索了自然感染状态下迷走神经在免疫信息向脑传递过程中的作用。1材料和方法1.1小鼠体内细菌传代临床株鼠伤寒杆菌(第四军医大学西京医院细菌室提供)在昆明种小鼠体内传代2～3代以增强致病力,用生理盐水调整细菌数为1010/ml备用。1.2动物的诱导培养雄性SD大鼠随机分为4组(各5只),分别为:①假手术(sham)+生理盐水(NS);②手术(operation)+NS;③sham+细菌(STM);④operation+STM。4g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/Kg),2和4组动物在手术显微镜下,分离迷走神经前后干,尽量接近膈肌处切除迷走神经前后干各约1cm;1和3组动物仅暴露迷走神经前后干不剪断。大鼠恢复4w,连续4d进行抓摸训练。禁食、禁水24h后,在乙醚麻醉下灌胃30g/LNaHCO3300μl;继而3和4组动物再给予菌液1ml,1和2组动物给予同体积生理盐水。22h后,10g/L戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔注射麻醉,经心灌注。100ml生理盐水冲洗血液后,用预冷的40g/L多聚甲醛固定液400ml灌流。灌注完毕,取脑、回肠和肠系膜淋巴结放于200g/L蔗糖,4℃过夜。脑用滑动冰冻切片机冠状切片,片厚54μm,隔四取一;回肠和肠系膜淋巴结用恒冷箱切片机切片,片厚5μm,隔四取一。-20℃保存待用。1.3常规he染色回肠和肠系膜淋巴结贴片晾干,依次入二甲苯、梯度酒精、Harris苏木精、伊红、100%酒精、二甲苯常规HE染色,树胶封固。光镜观片并照相(OlympusBH-2显微镜)。1.4羊抗兔的ib/igg染色ABC方法染色:兔抗c-Fos抗体(1∶3000,SantaCruzTech.Inc.公司)孵育脑切片,室温36h,0.01mol/LPBS漂洗;生物素化的羊抗兔IgG(1∶500,Sigma公司)孵育切片,室温下4h,0.01mol/LPBS漂洗;生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC,1∶500,Sigma公司)孵育切片,室温2h。硫酸镍胺加强DAB蓝色反应呈色。裱片、脱水、透明和封片后,光镜下观片并照相。1.5该核团的fos阳性细胞计数结果取每只动物的每个核团对应的典型平面2～3个,在10(目镜倍率)×20(物镜倍率)光镜下观察计数,取该例动物各平面的平均数,即为该动物该核团的Fos阳性细胞计数;每组5个动物间取平均值,即为该组动物该核团的Fos阳性细胞数。t检验统计分析。2结果2.1各组大鼠肠黏膜上皮细胞的变化接受细菌刺激的3和4两组动物的回肠与未接受细菌刺激的1和2两组动物的回肠相比:肠腔中有较多的细菌;局部肠粘膜上皮细胞脱落、绒毛内中性粒细胞增多、红细胞增多、纤维母细胞增多(提示有组织修复存在)。同时,3和4组(Fig1B)动物的肠系膜淋巴结和1、2组(Fig1A)比较出现次级淋巴滤泡(淋巴结受到抗原刺激时出现),组织细胞增多。此结果提示3和4组动物的回肠和肠系膜淋巴结有炎症存在。2.2pvn的表达经细菌刺激的大鼠(3组)(Fig1D,G)与给予生理盐水的大鼠(1组)(Fig1C,F)相比,见PVN外侧部和SON背侧部的Fos阳性细胞数增加;4组(Fig1E,H)和3组(Fig1D,G)相比较,给予细菌刺激的大鼠,膈下迷走神经切断后,PVN的外侧细胞部和SON背侧Fos表达减少;2组与1组比较,仅膈下迷走神经切断后,PVN内侧部Fos减少。各核团Fos阳性细胞计数如Tab1。aP<0.05vsSham+NS;bP<0.05vsSham+STM3pvn细胞间免疫反应的互动关系免疫系统和神经系统之间存在着复杂的相互作用,免疫系统接受抗原刺激迅速作出反应的同时,还把免疫信息传递到中枢神经系统(CNS),影响CNS的活动并接受CNS的调节。但是免疫信息的入脑途径,至今仍众说纷纭。以往的研究主要集中在体液免疫途径和神经免疫途径两个方面。目前有很多实验证据提示迷走神经在免疫信息向脑传递过程中可能起重要作用。本实验采用消化道内给予鼠伤寒杆菌的方式,真实地再现动物在自然条件下接受抗原刺激的状态。腹腔脏器的内脏感觉主要受迷走神经中的感觉纤维支配,通过切断膈下迷走神经观察鼠伤寒杆菌刺激后下丘脑室旁核(PVN)和视上核(SON)的Fos表达变化,进一步探索了自然感染状态下迷走神经在免疫信息向脑传递过程中的作用。Gaykema等报道,迷走神经切断仅能减弱低剂量LPS(≤20μg/kg)诱导的脑内Fos表达,而对高剂量LPS(≥100μg/kg)无效,后者可以导致LPS或IL-1β进入血液循环。如果细菌入血,或其毒素入血,均可刺激免疫细胞产生促炎性因子(IL-1β,IL-6和TNF-α)。本实验选用鼠伤寒杆菌造成轻度感染,旨在使胃肠道局部感染细菌后,产生局部炎症,使炎症仅局限于肠粘膜及肠系膜淋巴结,最大限度地减少其影响血液或其他部位,以便能在比较单一的条件下观察膈下迷走神经的作用,防止血源性途径或其他途径干扰对膈下迷走神经作用的观察。经细菌刺激的大鼠(3组)与给予生理盐水的大鼠(1组)相比,见PVN外侧部和SON背侧部的Fos阳性细胞数增加(P<0.05),PVN内侧小细胞部细胞无明显变化。早已熟知,中枢神经系统,尤其下丘脑参与协调急性期反应的各个方面。PVN内侧大细胞部和SON背侧部的神经元主要是催产素能神经元,大量的文献报道催产素能神经元参与神经免疫调节:比如Yang经研究认为,下丘脑PVN作为神经免疫调节的整合中枢,主要通过三个途径来发挥作用,一是CRH神经内分泌途径,二是催产素神经内分泌途径,三是PVN-脊髓交感神经途径。SON背侧部的神经元是催产素能神经元,本实验此部位的Fos阳性细胞数增加,说明此部位的催产素能神经元在STM刺激下有功能活动,与文献报道相吻合。PVN外侧细胞部神经元尚不能断定是催产素能还是加压素能,需进一步通过双标记染色鉴定,也不排除PVN催产素能神经元的激活。本实验结果显示室旁核内侧部神经元Fos表达无明显变化,提示CRH神经元未被明显激活,这可能反映了在免疫应答的初期,免疫反应处于启动阶段,对免疫反应起抑制作用的下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)的活动此时处于非激活状态,以便使机体的免疫系统充分发挥作用,清除外来抗原或致病物;只有当免疫反应达到一定强度,才能启动HPA轴,使免疫反应达到平衡状态:Besedovsky和Shek认为,去甲肾上腺素(NE)对CRF神经元具有抑制作用,动物受到绵羊红细胞刺激后,PVN内NE的含量下降,导致了CRF神经元的激活和CRF的释放;但是,只有在高免疫反应性动物才能观察到下丘脑NE的下降和血中糖皮质激素水平的升高。由结果中可以看出,仅迷走神经切断本身,即可使PVN内侧部Fos表达显著减少(P<0.05),PVN外侧部和SON背侧部Fos表达也有所减少(P>0.05),说明迷走神经在感受腹腔各种信息中的重要性。胃肠道受到细菌刺激的大鼠,在切断膈下迷走神经后,PVN外侧部和SON背侧部Fos表达显著减少(P<0.05),进一步说明膈下迷走神经在感受腹腔免疫信息中的作用。通过以上可以得出结论,迷走神经在免疫应答过程中,特别是在免疫反应的早期阶段确实发挥传递腹腔免疫信息的作用。结果中还可以发现,膈下迷走神经被切断的