健康受试者单剂量替米沙坦片人体药动学与生物等效性研究

健康受试者单剂量替米沙坦片人体药动学与生物等效性研究

氨基葡萄糖是一种非活性血管紧张素受体（at1亚型）抗剂。它可以选择性地阻断ag与许多组织（如血管平滑肌和肾上腺at1的结合，阻止血管收缩，促进类固醇的代谢。它对高血压和高血压的治疗有效。替米沙坦具有高选择性、高亲脂性、高特异性及药物不良反应轻微等优点,且较同类药物生物利用度高、半衰期长,是长效、高效、低毒、耐受性良好的新型抗高血压药物,适用于对其他降压药不能耐受或过敏的各型高血压患者。本研究以进口替米沙坦片为参比制剂,对国产替米沙坦胶囊和片剂进行健康人体药动学及相对生物利用度的研究,为临床用药提供参考依据。材料和方法1数据处理及自动进线API4000型三重四极杆串联质谱仪,配有大气压化学离子化源(APCI)以及Analyst1.3数据处理系统(美国AppliedBiosystem公司);Agilent1100二元输液泵和Agilent1100自动进样器(美国Agilent公司);ZorbaxExtendC18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm)(美国Agilent公司)。2替米沙坦胶囊、片、相对分子质量检测参比制剂:替米沙坦片(Micardis,美卡素)由德国BoehringerIngelheim药厂生产,80mg/片,批号:202019;受试制剂替米沙坦胶囊由北京北大维信生物科技有限公司提供,40mg/粒,批号:030201;受试制剂替米沙坦片剂由北京天衡药物研究院提供,40mg/片,批号:030701。替米沙坦对照品(纯度:99.7%)和内标物非那雄胺(纯度:99.5%),均由四川倍达尔新技术开发有限公司提供。甲醇和乙腈为色谱纯,购自天津市康科德科技有限公司;二氯甲烷为分析纯,购自沈阳市经济开发区试剂厂;乙醚为分析纯,购自天津市博迪化工有限公司;试验中各种溶液的配制均使用双蒸馏水。3般资料及不稳定因素试验计划经辽宁省人民医院医学伦理委员会批准,选择健康男性志愿受试者18例,年龄为(21.8±1.3)岁,身高(174.1±7.4)cm,体重(65.9±7.6)kg,体质指数为(21.7±1.7),符合要求。受试者于试验前在医院接受全面的体格检查,证明肝及肾功能,心电图等各项指标均正常。受试者无既往病史和药物过敏史,精神状态良好,平时很少服药,不吸烟,不嗜酒,试验前14d未用任何药物。所有受试者在被告知所有与本试验有关的情况及可能出现的不良反应后,签署书面的知情同意书。4替米沙坦胶囊组研究采用3制剂3周期的二重3×3拉丁方试验设计。18例受试者随机分成3组,每组6例,于试验前一日晚8:00开始禁食,试验当日晨7:00空腹口服含替米沙坦80mg/片的进口替米沙坦片剂1片,或含替米沙坦40mg/粒的国产替米沙坦胶囊2粒,或含替米沙坦40mg/片的国产替米沙坦片2片。服药2h后方可饮水,服药2和5h后进食统一的标准餐,3个周期的食谱相同。服药后受试者在室内休息,采血期间禁烟酒、含咖啡因类和果汁类饮料,避免剧烈运动。于服药前(0h)和服药后0.33,0.67,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,7.0,10,13,24,48和72h由前臂静脉取血3mL,并立即移入经肝素处理的离心试管中,静置5min后,离心10min(3500r·min-1),分离血浆,于-20℃冰箱中保存待测。周期间的清洗期为14d。5方法的回归方程流动相为乙腈-水(70:30),流速为0.8mL·min-1,柱温为25℃。离子源为APCI源;离子源电流4.5μA;温度为450℃;源内气体1(N2)压力为0.75L·min-1;气帘气体(N2)压力为0.15L·min-1;检测方式为正离子方式检测;扫描方式为多重反应监测(MRM);DP电压为50V;碰撞气(N2)压力为5Pa;用于定量分析的离子反应分别为m/z515→276(替米沙坦)和m/z373→305(内标非那雄胺);扫描时间为0.3s。向250μL血浆中分别加入50μL甲醇-水(50:50),100μL内标溶液(2μg·mL-1非那雄胺水溶液),混合后加入3mL提取溶剂二氯甲烷-乙醚(2:3),涡流混合1min,往复振荡10min(240次·分-1),离心5min(3500r·min-1),分取上层有机相于另一试管中,40℃空气流下吹干,残留物加入100μL流动相溶解,涡流混合,取20μL进行LC-MS-MS分析。取空白血浆250μL,加替米沙坦标准系列溶液50μL,配制成相当于替米沙坦血浆浓度为0.24,0.48,1.0,4.0,16.0,40.0,100,200,500和1000ng·mL-1的血浆样品,按“血浆样品的处理”项下依法操作,每一浓度进行双样本分析,进样20μL,记录色谱图;以待测物浓度为横坐标(x),待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标(y),用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算,求得的直线回归方程即为标准曲线。取空白血浆250μL,按“标准曲线和定量下限”项下方法配制替米沙坦低、中、高3个浓度(替米沙坦分别为0.48,40.0和800ng·mL-1)的质量控制(QC)样品,6样本,连续测定3d,并与标准曲线同时进行,计算QC样品的测得浓度,与配制浓度对照,求得本法的准确度与精密度。取空白血浆250μL,按“标准曲线和定量下限”项下的方法制备低、中、高3个浓度(替米沙坦分别为0.48,40.0和800ng·mL-1)的样品,每一浓度进行6样本分析。同时另取空白血浆250μL,除不加标准系列溶液和内标外,按“血浆样品处理”项下操作,向获得的上清液中加入相应浓度的标准溶液50μL和内标100μL,涡流混合,40℃空气流下吹干。残留物以流动相溶解,进样分析,获得相应峰面积(3次测定的平均值)。以每一浓度2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。取空白血浆250μL,配制替米沙坦低、中、高3个浓度(替米沙坦分别为0.48,40.0和800ng·mL-1)的血浆样品,考察替米沙坦血浆样品经过3次冷冻-解冻循环,室温放置4h,-20℃下保存30d,以及经处理后在室温下放置24h的稳定性。6药-时曲线auc0t的测定药动学数据的处理使用了Topfit2.0软件(德国ThomaeGmbH公司)。采用非室模型法计算各组药动学参数,达峰浓度(Cmax)和达峰时间(Tmax)为实测值,对药-时曲线进行对数线性回归求得消除速率常数ke,消除半衰期t1/2=(ln2)/ke,采用梯形法计算AUC0～t,AUC0～∞=AUC0～t+Ct/ke(Ct为最后一个可测量点的浓度)。AUC,Cmax经对数转换后,进行三交叉试验设计的方差分析,并计算90%置信区间,Tmax经Wilcoxon检验,以进口替米沙坦片为参比对国产替米沙坦胶囊和片剂进行生物等效性评价。结果1替米沙坦血浆样品的测定在上述色谱和质谱条件下,空白血浆样品的色谱图,空白血浆中加入替米沙坦至0.24ng·mL-1和内标非那雄胺至800ng·mL-1的色谱图、1例受试者服用80mg替米沙坦后1.0h血浆样品的色谱图见图1。结果表明,空白血浆中内源性物质不干扰替米沙坦及内标物的测定。2检测限和定量下限替米沙坦的线性范围为0.24～1000ng·mL-1,定量下限为0.24ng·mL-1,本方法的检测限可达到0.05ng·mL-1。典型的线性方程为y=1.56×10-4x+3.98×10-5,r=0.9969。3方法的精度和精度计算QC样品的测得浓度,与配制浓度对照,求得本法的准确度与精密度,结果见表1。4冷冻-解冻循环次数替米沙坦在3个浓度0.48,40.0,800.0ng·mL-1的血浆样品提取回收率分别为65.4%,65.3%和65.8%。经过考察,替米沙坦血浆样品经过3次冷冻-解冻循环,室温放置4h,-20℃下保存30d,以及经处理后在室温下放置24h稳定。以上几种情况下,低、中、高3个浓度的血浆样品浓度的实测值相对于加入浓度的误差不超过±11.4%。5血液中药物浓度的测量对于血浆药物浓度超过定量上限的样品,用空白血浆稀释后重新测定。18例健康受试者单剂量口服3种制剂的平均血药浓度-时间曲线见图2。6替米沙坦胶囊和片的相对生物利用度采用非室模型计算药动学参数的结果见表2。国产替米沙坦胶囊和片剂对于进口替米沙坦片的相对生物利用度分别为(113.9±32.7)%和(108.0±31.9)%。7替米沙坦胶囊的质量评定对Cmax和AUC0～t进行对数转换后,经方差分析,结果表明:制剂间及周期间无明显差异,而受试者个体间有差异。用90%置信区间分析进行等效性评价,Tmax用秩和检验的方法进行评价。国产替米沙坦胶囊和进口替米沙坦片比较1nCmax和lnAUC0～t的90%置信区间分别为:(85.0,136.5),(97.0,122.6);对Tmax进行Wilcoxon检验T=41.5,差异无统计学意义(P>0.05);国产替米沙坦片和进口替米沙坦片比较,lnCmax和lnAUC0～t的90%置信区间分别为:(71.9,115.5),(92.7,117.1);对max进行Wilcoxon检验T=57,差异无统计学意义T(P>0.05)。生物等效性研究本试验中建立了测定人血浆中替米沙坦的LC-MS-MS分析方法,只需使用250μL血浆样品,血浆样品经液-液萃取法进行处理,利用MRM扫描方式,以准分子离子[M+H]+为母离子,利用生成的主要碎片离子进行定量分析,每个样品的分析时间仅为2.3min,检测限可达0.05ng·mL-1。血浆中的内源性物质不干扰待测物的测定。该方法血浆用量少,在专属性、准确性、灵敏度和分析速度方面均优于以前曾报道过的方法。本试验研究结果表明,18例健康志愿者单次口服替米沙坦2种受试制剂与参比制剂80mg后,3种制剂的吸收、分布过程相似,方差分析和双单侧t检验证明3种制剂具有生物等效性。统计分析表明,3种制剂中替米沙坦的Cmax,AUC0～t,AUC0～∞在个体间差异有统计学意义。健康受试者口服40和80mg的替米沙坦片后,Cmax的最大变异系数达到71.7%,AUC0～t的最大变异系数为59.0%,AUC0～∞的最大变异系数为65.9%。说明该药在中国健康受试者体内个体差异较大。故临床应用替米沙坦时,给药方案应个体化。国外学者报道,口服80mg替米沙坦的主要药动学参数值如下:Cmax为(693±606)ng·mL-1,t1/2约为24h,AUC0～∞为(3728±3356)ng·h·mL。本试验的药动学参数值与国外学者报道相比,t1/2非常相似,而Cmax,AUC0-t和AUC0～∞值偏高。这说明中国人与白种人间可能存在药动学上的种族差异,有待进一步研究。文献报道细胞色素P450酶不参与替米沙坦在