液相色谱-质谱联用法测定人血浆中西替利嗪

液相色谱-质谱联用法测定人血浆中西替利嗪

盐酸二甲酯是抗组胺药物羟基二甲酯的活性羧酸衍生物。这是第二代抗组胺药物羟基吡啶的选择性抗剂。它对抗过敏效果很强，而且很持久。它可以抑制脂肪和大的细胞颗粒，抑制过敏反应部分的移动，并尝试皮肤组织的浸润，没有明显的中间诱导副作用。西替利嗪是第一代H1受体羟嗪的活性羧酸代谢物,在体内不易被细胞色素P450所代谢,大部分经肾脏以原型药物排出。目前已在国内外获准上市,临床主要用于防治(季节性和非季节性)过敏性鼻炎、慢性特发性荨麻疹、过敏性哮喘、特异性皮炎等疾病。在此之前的研究中,测定人体内西替利嗪的方法一般为高效液相色谱-紫外检测或荧光检测,灵敏度低,达不到血浆中微量西替利嗪的检测要求。此外紫外检测缺乏特异性,不能完全排除内源性物质的干扰。因此本文在前人的研究基础上,建立了测定人体内西替利嗪浓度的液相色谱-串联质谱方法(HPLC-MS/MS),检出限为0.50μg/L,并用于西替利嗪片剂在人体内的药代动力学研究以及生物等效性研究。1实验部分1.1内标物:替米沙坦对照品,制备了马立克氏盐酸西替利嗪标准品(批号040501):纯度≥99.5%,浙江浙北药业有限公司提供;内标物:替米沙坦对照品(批号030208):纯度≥99.5%,北京德众万全药物技术开发公司提供;乙腈(色谱纯,迪马公司);水为重蒸去离子水;乙酸乙酯、CH2Cl2、枸橼酸钠、枸橼酸均为分析纯,由广州市化学试剂厂提供。1.2高效液相色谱数据处理安捷伦1100LC/MSDXCT离子阱质谱仪,配有电喷雾离子源及AgilentChemStations数据处理软件,Agilent1100高效液相色谱系统;电子天平(瑞士SARTORIUS);XW-80A旋涡混合器(原上海医科大学仪器厂);高速离心机(美国MICRO12-24);真空干燥箱(德国MMM-GROUP)。1.3流动相v乙腈v1%苯甲酸水色谱柱:AgilentZorbaxSB-C18(2.1mm×150mmi.d.,3.5μm);流动相:V(乙腈)∶V(1%甲酸水)=55∶45溶液;流速:0.5mL/min;柱温:25℃;进样量:5μL。1.4离子化模式离子源为电喷雾离子源(ESI);毛细管电压(Capillary)5000V;毛细管出口电压(CapillaryExit)113.5V;雾化气压力(Nebulizer):3.10×105Pa,干燥气流量:9L/min,干燥气温度:350℃;离子化模式:正离子化(positive);扫描方式为多重反应监测(MRM)。用于定量分析的离子分别为m/z389→201(西替利嗪)和m/z515→497(替米沙坦)。1.5标准工作液的配制准确称取盐酸西替利嗪标准品适量(相当于西替利嗪10.0mg),置于10mL容量瓶中,用V(乙腈)∶V(水)=1∶1混合溶液定容,即配制成1.0g/L的西替利嗪贮备液,贮存于4℃冰箱避光保存备用。试验前按试验所需稀释成相应浓度的标准工作液。另配制100μg/L的内标替米沙坦乙腈溶液。1.6枸杞酸钠溶液取含药血浆0.5～10mL的带塞磨口玻璃锥形离心管中,加入100μg/L的替米沙坦乙腈溶液50μL,快速振荡3s,加入0.1mol/L枸橼酸钠水溶液(pH6)0.5mL,振荡10s,再加入V(乙酸乙酯)∶V(CH2Cl2)=4∶1混合溶液3mL,密塞,旋涡振荡2min,3500r/min下离心5min,吸取有机层置3mL的带塞磨口玻璃锥形离心管内,37℃真空干燥箱中干燥至干。进样前加入V(乙腈)∶V(水)=1∶1混合溶液200μL,快速振荡10s使残渣溶解,3000r/min下离心5min,吸取上清液5μL进样。2结果与讨论2.1峰:m/z39西替利嗪和内标物替米沙坦在电喷雾离子化方式下,主要生成[M+H]+准分子离子峰,分别为m/z389和m/z515。对[M+H]+进行产物离子扫描(见图1),生成的主要碎片离子分别为m/z389→201(西替利嗪)和m/z515→497(替米沙坦),将这些主要碎片离子作为定量分析时监测的产物离子。2.2空白血浆样品前处理分别取6名受试者的空白血浆0.5mL,分别按照上述的血浆样品前处理操作,进行分析。结果表明空白血浆样品中内源性物质不干扰西替利嗪及内标替米沙坦的测定。志愿者给药后采集的血浆样品色谱图见图2。2.3回收率及精密度取空白血浆0.5mL共24份,分别加入0、25、50、100、500、1000、2000和4000μg/L的西替利嗪标准溶液50μL(1式3份),振荡3s,使血浆药物浓度相当于0、2.5、5.0、10.0、50.0、100、200和400μg/L,然后按“1.6血浆样品处理”项处理。经HPLC-MS/MS分析,以血浆西替利嗪质量浓度(ρ)为纵坐标,药物西替利嗪峰面积与内标峰面积之比(F)为横坐标,用最小二乘法进行回归分析,结果表明血浆中西替利嗪质量浓度在2.50～400μg/L范围呈良好的线性关系,回归方程及相关系数分别为:ρ=44.04F+1.08,r=0.9993(n=7)。最低定量下限浓度为2.50μg/L,平行对浓度为2.50μg/L的6个含药血浆样品处理后进行色谱分析,其提取回收率平均为97.3%,RSD为9.4%。检出限为0.50μg/L(S/N=3)。2.4提取回收率测定按2.3节分别配制低(5.0μg/L)、中(200μg/L)和高浓度(300μg/L)的西替利嗪血浆溶液各15份,分为3批,每批5份,并与每批的标准曲线同时进行检测,依“1.6血浆样品处理”项处理后进行分析。同时将空白血浆,加入溶剂萃取处理后,再加入相应浓度的西替利嗪和替米沙坦,按1.6节处理后,进样分析。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算提取回收率,见表1。结果表明,本法的回收率稳定,能满足样品分析的需要。2.5质控样品质控按2.3节分别配制低(5.0μg/L)、中(200μg/L)、高浓度(300μg/L)的质控样品,每个浓度6样品分析,分为两组,每组每个浓度3个样品。考察了样品分别经室温放置24h和48h、-20℃下冻存7d和14d、冻融3次的稳定性。不同浓度样品检测结果的RSD均小于15%。2.6血浆样品检测按2.3节分别配制低(5.00μg/L)、中(200μg/L)、高浓度(300μg/L)的血浆样品置-20℃冻存备用。检测每批血浆样品前需做随行标准曲线,并同时检测质控样品。结果表明随行标准曲线线性良好,低、中、高3个浓度质控样品的偏差均在±15%内,符合体内药物分析要求,本试验血浆样品的测定结果准确、可靠。2.7静脉血样前处理经医学伦理委员会批准,选择健康志愿者20名,空腹12h,分别口服西替利嗪10mg,于给药前0h及给药后0.25,0.5,0.75,1,1.5,2,2.5,3,4,5,6,8,10,12及14h,经静脉留置针取前臂静脉血5mL/次,4℃离心分离血浆,按“血浆样品前处理”方法进行色谱分析。将受试者单剂量试验后的血药浓度列表并计算均值及标准差,绘制血药浓度-时间曲线,如图3所示。3样品分析结果本文建立的LC-MS方法,采用MRM(多重反应监测)扫描方式,同时对待测物的母离子和产物离子进行检测,提高了方法的灵敏度和选