病毒分离培养

细胞培养技术标本的采集从病原体入侵部位取材:流感病毒取咽喉拭子从病原体感染的靶器官取材:HIV患者取血从病原体排泄途径采集:HAV、HEV及轮状病毒从环境取材：空气、水、土壤、生物材料等采集原则：早期采集采集标本：血液、尿液、胃液、精液、脑脊液、分泌物环境标本、媒介生物第一节标本的采集和处理标本的运送与储存注意事项标本采集后尽快送检不能及时检验，应注意保存不怕冷的标本温度越低越好血液标本等4℃保存采集标本时注意防护，避免被感染标本的处理鼻咽等拭子标本的处理：加1000U/ml的青霉素和链霉素处理后再离心血液标本的处理需抗凝血，离心后取血浆粪便标本加10000U/ml的青霉素和链霉素处理，过夜后加适量Hanks液和石英，使病毒充分释放，离心后取上清尿液标本的处理加1000U/ml的青霉素和链霉素处理，4℃作用4h脑脊液标本的处理组织标本的处理先剪成碎块后再匀浆，再按粪便标本方法处理生物标本的处理类似组织标本水体标本标本的处理第二节病毒的分离组织培养法（tissueculture）定义：是指将机体（包括人和动物）组织或细胞，在体外模拟机体内生理条件，使之生存或分裂繁殖常用细胞培养法组织培养法的种类原代细胞培养（primarycellculture）来源人的胚胎组织或正常组织，敏感性强，但只能传几代常见的原代细胞：人胚肺、人胚肾、人胚肝、鸡胚、地鼠肾、地鼠肝、猴肾等组织培养法二倍体细胞培养（diploidcellculture）定义：是指染色体仍保持二倍体特性，染色体总数为46条，缺点：一般只传50代许多病毒对它敏感，可用于分离病毒和疫苗生产常见的有：WI-38、WI-26传代细胞（continuouscell）由原代细胞连续传代或肿瘤细胞培养所建立的常见的有：BHK21（传代地鼠肾）、HeLa（宫颈癌）、Vero（传代非洲绿猴肾）、A549（人肺癌）鸡胚接种法应用某些病毒分离鉴定流感病毒、副粘病毒、疱疹病毒、痘病毒可作为体外细胞培养材料不同病毒接种在鸡胚的不同部位绒毛尿囊膜接种选10~12天的鸡胚，增殖后形成清晰的斑点状或痘疱如天花病毒、新城疫病毒、单纯疱疹病毒、VZV、狂犬病毒等尿囊腔接种先在绒毛尿囊膜的内胚层增殖，并释放病毒至尿囊液可用血凝试验和血凝抑制试验等鉴定常见的病毒：流感病毒、流行性腮腺炎病毒、东方马脑炎病毒羊膜腔接种流感病毒、流行性腮腺炎病毒等，收集羊水卵黄囊接种鸡胚接种法动物接种法动物的选择动物的易感性:选择动物首要条件动物的健康状况:动物的品系:纯系动物较好动物的性别、年龄、体重年龄、体重适中的动物，小鼠18~22g，家兔1.8~2.5g分离乙脑病毒需要乳鼠，鉴定病毒选雄性动物，制备抗体选雌性动物动物的接种脑内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、角膜、皮肤等病毒的采集动物的血液检测抗体分致死性和非致死性采血，采血前应空腹采血方法：心脏采血、颈静脉采血、颈动脉采血、耳静脉采血、眼眶采血等动物接种法动物实验注意事项动物实验必须达到相应的安全等级SARS—BSL-3级；埃博拉病毒在BSL-4级最好操作者接种疫苗，穿好防护服，预防感染注意防止病毒扩散和污染环境，应彻底消毒和灭菌应注意动物本身携带的病毒如鼠脑脊髓炎病毒分子生物学技术；克隆全基因，表达病毒颗粒物理法动物接种法第三节病毒的鉴定初步鉴定根据临床表现、流行特征与标本来源如夏秋季节从脑炎患者脑脊液分离，考虑乙脑东北林区从脑炎患者脑脊液分离，先考虑森林脑炎秋季从腹泻病人粪便分离病毒，先考虑轮状病毒从发烧小儿粪便分离病毒，出现下肢瘫痪，先考虑脊髓灰质炎初步鉴定生物学特性细胞病变效应（CPE）细胞融合产生多核巨细胞，如流感、副流感、腮腺炎、疱疹等出现巨大细胞：在人胚肺考虑巨细胞病毒细胞圆缩、变小：肠道病毒细胞肿大，聚集成葡萄状：腺病毒血凝现象和血吸附血凝现象：如流感病毒、风疹病毒的HA血吸附现象：新城疫病毒能吸附和凝集豚鼠红细胞病毒干扰现象：一种病毒感染细胞后，可以干扰另一种病毒在细胞内的增殖如鼻病毒可吸附人或豚鼠红细胞，如先接种仙台病毒则干扰鼻病毒的增殖，不能吸附红细胞初步鉴定理化特性核酸类型鉴定：一组加抑制DNA增殖的药物5-氟脱氧尿苷，另一组不加若病毒增殖明显抑制的属DNA病毒，反之属RNA病毒脂溶剂敏感试验：乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等破坏病毒包膜而失去感染性乙醚鉴定法：用乙醚处理后的试验组跟对照组同时测定病毒滴度，若滴度下降明显（2个对数值），说明对乙醚敏感，属于包膜病毒初步鉴定耐酸性试验：鉴别肠道病毒和鼻病毒肠道病毒对酸有抵抗力，而鼻病毒没有先用酸调pH3.0，再调到pH7.2，为试验组若试验组病毒滴度下降明显（2个对数值），差异明显，说明病毒对酸敏感，反之属于肠道病毒接种动物的观察观察指标：感染动物的潜伏期：乙脑小鼠脑内接种潜伏期为4天，狂犬病毒接种潜伏期6~8天动物饮食、体重和体温；局部和全身反应 初步鉴定最终鉴定血清学与免疫学方法中和试验:病毒中和抗体和病毒抗原结合后,使病毒不能吸附于敏感细胞,或两者结合后抑制了病毒的穿入和脱壳,使病毒失去感染性结果判定:细胞培养时可依据细胞病变情况、蚀斑数量、颜色反应；鸡胚试验依据鸡胚死亡数、绒毛膜囊斑点数量和特征等动物试验可依据动物死亡数、发病数、症状等常用方法：一种是固定病毒用量，一般用100TCID50，与等量的倍比稀释血清；一种是固定血清用量与等量的倍比稀释的病毒最终鉴定注意事项病毒用量，一般用100TCID50动物血清要灭活：人和豚鼠血清要56度，兔血清要65度避免使用相同来源的细胞和抗体：如兔肾繁殖制备的抗体血清注意无菌操作血凝抑制试验原理：病毒+红细胞病毒+抗体+红细胞注意事项：不同病毒试验要求不一样；红细胞、血凝素、反应温度注意对非特异性抑制物处理；如乙醚、丙酮等注意设置对照：红细胞对照、血清对照、血凝素对照最终鉴定凝集不凝集免疫荧光原理：荧光素标记的抗体，和相应的抗原特异性结合形成免疫复合物，借助荧光免疫镜看见荧光。DNA病毒在细胞核内复制，腺病毒、乳头瘤病毒等在核内荧光颗粒；RNA病毒在细胞浆内复制，如风疹病毒、麻疹病毒等方法：直接法和间接法最终鉴定操作步骤制备含病毒抗原的细胞片：让细胞在载玻片中生长冷丙酮固定，再荧光抗体染色荧光显微镜观察注意事项：细胞生长在玻片上荧光抗体不要超过保质期洗涤要充分最终鉴定最终鉴定酶免疫学试验免疫组织化学ELISA：间接法和双抗体夹心法病毒基因的鉴定PCR提取病毒DNA变性：双链变单链95℃1min退火：上下游引物与模板DNA互补结合延伸：在72℃30s~1.5min循环次数：30次左右电泳检测病毒基因的鉴定RT-PCRTRIZOL试剂抽提RNARNA反转录:(Reversetranscription)逆转录酶作用反转录成DNAPCR病毒基因的鉴定Southernblot:测病毒DNA待测核酸样品的制备与限制酶消化先提取病毒DNA,再消化较长的DNA电泳分离DNA电泳凝胶的预处理碱变性可保持DNA单链易杂交转膜:NC膜,虹吸法探针标记预杂交与正式杂交洗膜和放射自显影病毒基因的鉴定病毒基因的鉴定DNA测序制备膜板DNA，与引物退火膜板DNA延伸加ddNTP终止反应SDS电泳，并剥离干燥读片