两种方法检测支气管肺灌洗液细胞分类的比较

两种方法检测支气管肺灌洗液细胞分类的比较

支架气泡压缩性技术是一种通过纤维支气管镜对气管以下肺段或亚段的无菌生理盐水进行反复过滤、回收、检测和分析的技术。BAL检查可直接获取下呼吸道及肺泡上皮表面衬液,即支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF),通过对其所含的炎症细胞、免疫细胞进行细胞计数和淋巴细胞亚群测定,可为结节病、过敏性肺泡炎、特发性肺间质纤维化及肺部恶性肿瘤等疾病的诊断、鉴别诊断和疗效观察提供重要手段。临床实验室既往多根据2002年发布的《支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范(草案)》规定进行BALF细胞分类计数,采用手工制片、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色法或瑞氏染色法,其操作步骤繁琐,费时费力,不适于标本量日渐增多的常规检测;且通常使用的细胞采集液中含有乙醇等成分,细胞形态结构因固缩变小而不易被清晰辨认。为此,本研究简化了制片步骤并通过自动化瑞氏吉姆萨(Wright-Giemsa)染色法进行细胞分类计数,省去细胞收集液,使得淋巴细胞及中性粒细胞的识别更加清晰,提高了BALF细胞分类计数的可靠性。1balp基因检测1.1仪器与试剂细胞收集液(ThermoShandon公司);HE染液(哈尔滨格林公司),瑞氏吉姆萨染液(珠海贝索公司),滤纸、漏斗、Cytospin细胞离心涂片机(ThermoScientific公司),改良Neubauer细胞计数版。Multifuge4KR离心机(Heraeus公司),SP-1000i自动推片染色机(Sysmex公司),CX41普通光学显微镜(Olympus公司)。1.2标本采集及制备50例BALF标本来自2013年4~9月北京协和医院门诊和住院患者。每位患者行支气管镜检查时,留取≥5mL的BALF,装入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中(减少细胞粘附),1h内送检。在改良Neubauer细胞计数板上计数细胞总数。1.3传统制片和手工HE染色法(传统法)操作流程见图1。1.4改良制片和自动化瑞氏吉姆萨染色法(改良法)操作流程见图1。1.5显微镜检查由两名具有专业技术能力的检验人员完成。针对每份标本,检验人员在光学显微镜下计数200个细胞,并进行细胞分类计数。1.6统计学分析用SPSS19.0软件对两人员间的细胞分类结果进行线性回归分析,评估两人员间结果的一致性。然后对两人员的计数结果取均值,通过SPSS19.0软件线性回归分析评估两种方法间细胞分类结果的一致性。2细胞形态检测2.1BALF细胞分类计数结果2.1.1人员间的BALF细胞分类计数结果比较在传统法细胞分类计数中,两人员间计数结果的回归分析显示:吞噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的相关性良好,相关系数(r)分别为0.989(P<0.01)、0.989(P<0.01)、0.985(P<0.01)和0.976(P<0.01)。在改良法细胞分类计数中,两人员间计数结果的回归分析显示:吞噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的相关性良好,r分别为0.982(P<0.01)、0.986(P<0.01)、0.981(P<0.01)和0.969(P<0.01)。结果表明,两人员间两法的细胞分类计数结果一致性均良好。2.2两种方法检测不同类型细胞形态的比较图2~5显示了在油镜下观察的两种方法对吞噬细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的染色形态。瑞氏吉姆萨染色片中,细胞核被染成紫红色,细胞浆被染成蓝色。HE染色法中,细胞核内的染色质与细胞浆内的核糖体着蓝紫色,细胞浆和细胞外基质中的成分着粉红色。改良的自动化瑞氏吉姆萨染色法染色的细胞形态完整,细胞核和细胞浆分辨清楚,可见颗粒、空泡等细微结构;而手工HE染色后的细胞固缩明显,细胞体积变小,细胞核和细胞浆分辨清晰度下降,颗粒和空泡等细胞结构辨认不清。2.3两种方法所需时间的比较由图1所示的操作流程图可明显看出,改良法比传统法省去了滤液离心富集细胞的过程(6min),并且使用自动化瑞氏吉姆萨染色法(20min)代替了手工HE染色法(30min),至少节省了15~20min的制片和染色时间。3细胞富集和细胞收集健康人的BALF中,单核/吞噬细胞计数>85%、淋巴细胞计数<12%、中性粒细胞计数<2%、嗜酸性粒细胞计数<1%。病理情况下,BALF的细胞组成会发生明显改变。当淋巴细胞计数>25%时,提示肉芽肿性肺病(如结节病、过敏性肺炎、非特异性间质性肺炎、淋巴细胞性间质性肺炎、隐源性机化性肺炎等),当淋巴细胞计数>50%,则高度提示过敏性肺炎和非特异性间质性肺炎。当嗜酸性粒细胞计数≥25%时,可协助诊断急性嗜酸性粒细胞性肺炎。中性粒细胞计数≥50%,可有力支持急性肺损伤、吸入性肺炎或化脓性感染的诊断。因此,BALF细胞分类计数能够为肺部病变性质、炎症过程及疾病活动性等提供重要的参考信息,近年来在国内外已普遍应用于呼吸系统疾病的诊断、预后和疗效观察。本研究建立的改良法与传统法BALF细胞分类计数有良好的一致性,但二者的操作流程却有明显的不同:改良法将过滤后的滤液直接用生理盐水调整细胞浓度,而传统法将滤液离心富集细胞后,再用细胞收集液调整细胞浓度;改良法用自动化瑞氏吉姆萨染色,而传统法用手工HE染色。传统法中用到的细胞收集液主要成分为乙醇、甲醇、异丙醇和聚乙二醇,具有破坏红细胞、固定有核细胞的作用,可防止细胞在染色操作中被破坏或丢失。但该液体也会使有核细胞固缩变小,使之在显微镜下结构不清,不易辨别,如图2-2、3-2、4-2、5-2所见。同时,红细胞残渣可能干扰细胞的正确辨认。改良法不用细胞收集液,主要因为瑞氏吉姆萨染液的溶剂即为甲醇,本身即有固定细胞的作用。改良法和传统法所获结果的一致性很好,并没有因为缺少细胞收集液而出现细胞被破坏或脱落的现象,所以改良法直接用生理盐水调整细胞浓度。对于细胞总数很少的BALF标本,将滤液离心富集细胞的过程是必要的,但根据本实验室的实际操作经验,95%的BALF标本不需要富集滤液细胞,可用生理盐水直接将细胞悬液调整至最佳浓度,以减少富集过程所需的时间。HE染色有两种主要染液:苏木精和伊红。苏木精在碱性溶液中呈蓝色,细胞核被染成蓝色。伊红是一种化学合成的酸性染料,在水中离解成带负电荷的阴离子,与蛋白质的氨基———正电荷的阳离子结合使胞浆染色,细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色,与蓝色的细胞核形成鲜明对比。由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样,各种组织或细胞成分与病变的一般形态结构特点均可显示出来,故HE染色更适用于细胞和组织病理学检查。而瑞氏吉姆萨染色法结合了瑞氏染色法和吉姆萨染色法的优点,对细胞胞核、胞浆和胞浆内颗粒均着色鲜艳,对比鲜明,常用于白细胞分类。因此,BALF的细胞分类计数,瑞氏吉姆萨染色更为合适。自动化瑞氏吉姆萨染色机已逐渐普及,可突现瑞氏吉姆萨染色法的优势。传统手工染色劳动强度大,而且有时会受温度、时间、试剂、环境及个体差异等因素的影响,胞浆、胞核染色深浅不一,颜色对比不强,而自动染片机预先设定好染色程序和时间,使得每一次染色的步骤和时间都能一致,胞浆和胞核结构经染色后清晰均匀,对比鲜明［9］。此外,自动染片机的操作简单,可缩短制片周期,批量染色更加节约时间,减少人力［10］。2.1.2两种方法的BALF细