生物技术专业毕业论文报告

青岛海域爆发浒苔的光合作用研究及分子鉴定

PhotosynthesisandmolecularidentificationoftheoutbreakoftheQingdaowatersEnteromorpha08生技三班赵许峰浒苔的根本性状浒苔Enteromorphaprolifera属于绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科、浒苔属,是一种常见大型海洋绿藻,藻体管状,膜质,细胞单层,主枝明显,分枝细长.幼体时期通过假根附着于固体基质生长,广泛地分布于潮间带区砂砾、岩石、泥滩上,成体藻体和断裂的成体藻体碎片可漂浮生长。青岛海域爆发浒苔的起源2023年黄海卫星照片显示证明绿潮起源于离青岛海域180km的江苏省海岸线。其主要原因是可能归结于江苏省沿岸的紫菜扩大养殖。之前有研究说明浒苔是紫菜养殖架上的主要污染海洋藻类，因此，在江苏省沿岸的22974公顷的紫菜养殖海域中，紫菜养殖架为浒苔的生物量累计提供了“温床〞。研究目的研究黄海浒苔爆发地区浒苔的光和作用，并对青岛地区爆发浒苔进行分子生物学鉴定。材料来源本实验所应用的浒苔均采自青岛海域以及由国家海洋局第一研究所实验中心提供。实验试剂蔗糖，可溶性淀粉，琼脂糖，裂解缓冲液，变性缓冲液，异丙醇，70%的乙醇，去离子水，硫酸亚铁，酒石酸钾钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，水合茚三酮，氯化亚锡，苯酚，硫酸，无水乙醇，葡萄糖，0.45um微孔滤膜，甲酰胺，甲醇，冰醋酸。主要仪器722S型分光光度计，ZD2型自动电位滴定仪，SHAC型水浴恒温振荡器，YXQS46280型高压蒸汽灭菌器，GZX9146MBE型电热恒温鼓风枯燥箱，高速离心机，显微镜，电子显微镜，U-3310紫外分光光度计，Niskin采水器，CTD，0．45uM滤膜，高效液相色谱仪1.浒苔的分子鉴定采样站位与时间2023年7月9日至16目，研究人员跟随“北斗〞号科学考察船对卫星照片显示具有大面积绿潮藻类出现的黄海海域(北纬33.5度至北纬36度，东经120度至东经122度)进行调察，共采集到这一海域中22个站位的浒苔样品，其中包括20个站位的飘浮浒苔以及2个站位(J13及J20-1)的拖网样品。青岛的漂浮浒苔样品采自栈桥潮问带浒苔的分子鉴定将浒苔用无菌水清洗3遍，用吸水纸吸干，利用天根植物全基因组提取试剂盒〔DP320〕提取全基因组DNA。设计IST扩增引物设计分别为T1〔5，-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，〕与T2〔5，-TTCCTTTTGCTTATTGATATGC-3，〕，PCR反响体系为25uL，其中包括：10×PCRbuffer2.5uL，2.0mmol/LMgCl22.0uL，10mmol/LdNTPs0.5uL，10umol/L引物T1和T2各1uL，TaqDNA聚合酶〔Promega〕0.2uL，DNA模板1uL。反响条件为94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，循环30次；72℃继续延伸10min，4℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带回收纯化之后，送北京六合华大基因科技持股测序。用于序列分析以及系统进化分析的浒苔及石莼的ITS及5.8SrDNA序列从NCBI数据库中下载。用ClustalW软件进行多序列比对记忆序列相似性分析。用Phylip3.65软件中最大简约法〔Maximumlikelihood〕和Mega4.0软件中的邻接法〔Neighbor-Joining〕构建系统发育树，重复1000次计算Bootstrap值。2.青岛海域漂浮和沉降浒苔的光合作用研究浒苔叶状体由专人乘中国科学院海洋研究所“创新号〞考察船于绿潮爆发期间在海况允许的情况下间断出海采集。本文选择经比较检测说明目前光合活性最高的2023年7月12日采集的青岛奥帆基地A赛区南侧海域(北纬36度,东经120度24分)水表藻体以及采自团岛湾(北纬36度20分，东经120度17分)泥表(图5)藻体,作为水表漂浮藻体和泥底沉降藻体的代表。用毛笔轻轻洗净藻体外表污泥和附生杂藻,并经显微镜镜检确认藻体无杂藻污染后待用。实验材料2.1叶绿素光谱特性及含量的测定取新鲜浒苔藻体，用滤纸轻轻吸干藻体外表水分，称取0.5g藻体放入研钵中液氮研磨。藻体磨碎后加少许石英砂和5mL丙酮继续研磨成匀浆状，参加5mL80%丙酮抽提。10000×g室温离心10min，弃沉淀，80%丙酮定容上清20mL。以80%丙酮作为空白对照，对样品进行350-800nm的波长扫描，读取663nm和645nm处的光密度值。重复3次以上，计算平均值

2.2叶绿素荧光参数的测定利用调制叶绿素荧光技术用IMAGING-PAMMicroscopy调制脉冲荧光仪通过叶绿素荧光诱导动力学曲线和光响应曲线测定了不同来源的浒苔叶状体叶绿素荧光动力学参数。样品暗适应15min以弱调制测量光测定初始荧光；以强饱和脉冲激发后测量最大荧光，重复5次。样品的快速光响应,同样通过IMAGING-PAMMicroscopy调制脉冲荧光仪测定。将经过光适应5min的样品，暴露在连续光强梯度(PAR3,26,46,65,102,146,195,259,337,418和497umolm-2s-1下，每步20s，测定相对电子传递速率ETR。2.3光合放氧速率测定样品预处理：取0.06g新鲜(FW)样品于20℃循环水浴中温浴15min。氧电极Oxygraph(Hansatech)测定其光合放氧速率，反响介质为20℃消毒海水，光照强度选择预实验测定的浒苔叶状体饱和光强600umolm-2s-1光合速率表示为每单位鲜重藻体的放氧速率以净光合放氧速率与呼吸耗氧速率之比获得P/R的值。2.4呼吸耗氧速率测定样品预处理：取0.06g新鲜样品于20℃恒温水浴中温浴15min,暗适应20Min。呼吸耗氧速率通过氧电极Oxygraph测定，反响介质为20℃消毒海水。呼吸速率表示为每单位鲜重藻体的耗氧速率。3.结果与讨论3.1分子鉴定结果取自23个不同站位浒苔样品的ITS序列以及5.8SrDNA序列的PCR片段总长度为540bp，其中ITS1长度为189bp，5.8SrDNA全序列长度为160bp，ITS2长度为181bp。从序列比对的结果内差异〔图6〕。将该序列与NCBI数据库中下载的石莼属以及浒苔属的ITS以及5.8SrDNA的序列进行比对，发现该序列与来自日本的一种浒苔属浒苔〔Enteromorphaprolifera〕的ITS以及5.8SrDNA序列的相似性最高，仅在第5个碱基处缺失一个碱基A。系统进化树

为构建系统进化树，从NCBI数据库中下载了l4个浒苔属及4个石莼属的ITS和5.8SrDNA的全序列，并以狭带藻的ITS和5．8SrDNA全序列作为外群。采用Mega4.0中的邻接(NJ)法及Phylip3.65软件中的最大简约法构建了ITS及5.8SrDNA的系统进化树，两棵进化树具有类似的拓扑结构，仅有Ulvapertusa的分枝不同，说明了系统进化树的可靠性。文中给出的是NJ法构建的ITS序列的系统树，从该系统进化树可以看出，本次绿潮浒苔与浒苔属浒苔(Enteromorphaprolifera)聚类在一起。基于NJ法构建的ITS序列的系统进化树3.2浒苔的光合作用研究结果

右图为浒苔样品提取色素的吸收光谱，叶绿素a的最大吸收波长在436和663nm,叶绿素b的最大吸收波长为463和645nm。如图8所示，奥帆A赛区南部水表(a)和团岛湾泥表(b)浒苔提取的色素样品具有相似的波形。由此可见，奥帆A赛区南部表层和团岛湾泥表浒苔具有相近的色素组成与比例。然而在色素含量方面却截然不同：奥帆A赛区南部水表漂浮浒苔的色素含量明显高于团岛湾泥表沉降浒苔。经计算,水表藻体叶绿素a和叶绿素b含量都明显比泥表藻体高,然而叶绿素a与叶绿素b的含量比却非常接近1.色素吸收光谱2.叶绿素荧光动力学参数

从浒苔藻体的光响应曲线(图9)可以看出,奥帆A赛区南部表层藻体的光响应曲线培养前后保持了比较稳定的状态,除了光饱和点和ETR值培养前和培养后相比略有下降外,在培养前和培养后保持了比较稳定的水平；而由图9(a)可见团岛湾泥表藻体的光响应在培养前就表现得比较微弱,在培养后那么完全失去了光响应(图9(b))。从图10(a)可以看出,奥帆A赛区南部水表藻体的参数值Fv/Fm约为0.6，比团岛湾泥表的藻体高出了7倍多,奥帆A赛区南部水表藻体的参数Y(Ⅱ)更是比团岛湾泥表的藻体高出了15倍有余。而从参数Y(NPQ)和Y(NO)的值来看,团岛湾泥表的藻体都比奥帆A赛区南部水表藻体高出了1倍。培养24h后可以看出,对于奥帆A赛区南部水表的藻体来说,参数Fv/Fm出现了明显的下降,从0.6左右下降到了0.5左右；参数Y(Ⅱ)稍有下降,而参数Y(NPQ)和Y(NO)都略有上升。对于团岛湾泥表的藻体,在培养24h后参数Fv/Fm,Y(Ⅱ)和Y(NPQ)降至0；与此同时Y(NO)上升到1(图10(b))。3.光和放氧和呼吸从图11(a)和11(c)来看，A赛区南部水表浒苔藻体的放氧速率、呼吸速率和P/R都显著高于团岛湾泥表藻体，其中放氧速率高出约达26.6倍，呼吸高出约3.5倍，P/R高出约5倍；从图11的比较中可以看出,在培养24h后团岛湾泥表藻体的放氧速率和P/R表现为负值，呼吸速率明显升高；而A赛区南部水表浒苔藻体的放氧速率和P/R仅稍有降低，呼吸速率有略微升高。4结果分析4.1分子生物学鉴定结果分析

目前对于藻种的鉴定已经越来越多的借助于分子生物学的方法。真核生物核糖体编码基因中18SrDNA，5.8SrDNA和28SrDNA组成一个转录单位，彼此被转录单元内间隔区ITS分开。ITS不属于编码区域，进化速率比编码区域快，即使是亲缘关系十分接近的物种，在该区域也存在核酸差异，而且随亲缘关系的疏远差异会迅速扩大。近年来，ITS序列在绿潮藻类及石莼属藻种鉴定方面起了重要作用。本次黄海绿潮，从不同站位采到的浒苔样品，形态观察差异较大，不管是藻体的颜色、主枝的形态和厚度、以及丝状体的形态和细胞的大小等均有明显差异，难以确定是否属于同一种浒苔。通过分子生物学检测发现所有这些浒苔样品都具有完全一样的ITS序列，从而确定造本钱次黄海浒苔绿潮的浒苔均同为一个种，聚类分析说明是浒苔属浒苔(Enteromorphaprolifera)4.2浒苔的光合作用研究结果分析这些结果说明,虽然漂浮藻体光合活性较强,但潜在光合活性明显低于正常值,而泥表藻体的光合活性极弱,提示截至2023年7月中旬该海域的漂浮浒苔藻体已受到了较严重的环境胁迫,说明青岛海域自然环境已不适于浒苔的生长,该海域浒苔生物量