【超高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒真菌毒素的实验探究5800字（论文）】

PAGE6超高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒真菌毒素的实验探究目录TOC\o"1-3"\h\u1前言 52材料与方法 52.1实验材料与试剂 52.2实验仪器与设备 52.3样品前处理 62.4基质效应试验 62.5线性范围、检出限（LOD）及定量限（LOQ） 62.6回收率和精密度实验 73结果与分析 73.1质谱条件的优化 73.2流动相的选择 73.3QuEChERS方法优化 83.4前处理方法的优化 83.5基质效应评价 103.6准确度与精密度 103.7实际样品测定 113结论 11参考文献 13

摘要:中国是世界上主要的葡萄及葡萄酒产区，葡萄酒的安全问题应该引起人们的重视。作为葡萄酒主要危害的真菌毒素，其引发的安全事故也受到人们的广泛关注。为减少由真菌毒素污染所引发的健康问题及葡萄酒损失问题，选择了几种常见、廉价的生物酶及生物活性物质，寻找将真菌毒素降解为无毒性物质的生物酶降解方法。并对其降解原理及降解途径进行阐述。建立葡萄酒中赭曲霉毒素A（OTA）、黄曲霉毒素B1（AFB1）、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、玉米赤霉烯酮（ZEN）、呕吐毒素（DON）、展青霉素（PAT）共八种真菌毒素同时检测的超高效液相色谱串联质谱检测方法，并对昌黎地区的50种葡萄酒进行了检测。结果表明：首先，八倍体积乙腈浸提，加入1g醋酸钠和4g无水硫酸镁，省略萃取净化步骤，提取液经离心、浓缩后直接利用UHPLC-MS/MS（超高效液相色谱-串联质谱技术）进行检测，效果最好。其次，八种真菌毒素的线性相关系数均不小于0.999，ILOD为0.001~0.005μg/L。在三个不同浓度标品的添加水平下加标回收率均在85%~110%之间，RSD在5.00%~10.00%之间，满足检测要求。然后，采用本方法对昌黎地区50种葡萄酒进行检测，与国家标准中真菌毒素在其他食品中的限量对比发现，均未超过规定限量最后，采用Design-Expert10.0软件进行响应面最佳条件优化，确定真菌毒素降解的最佳条件，为食品中真菌毒素的生物防治提供了方向。关键词：QuEChERS;真菌毒素;葡萄酒;方法优化研究；真菌毒素降解1前言中国是全世界葡萄酒主要的生产国家之一。随着葡萄酒产品质量的提高和葡萄酒产品结构逐渐完善的背景下，葡萄酒的受众也越来越多。20世纪以来，中国人均葡萄酒购买量保持每5年增长一倍的速度，从2012人均消费更是接近一升，目前已经达到在1.2~1.3升/人的消费水平。中国的第一瓶干红葡萄酒产自1983年的河北省昌黎县。自此，中国的葡萄酒产业便如雨后春笋一般蓬勃兴起，至今已成为家喻户晓的健康饮品。由于葡萄酒中含有大量乙醇，通过饮酒而摄入的真菌毒素可能会导致更加复杂的健康问题。由于葡萄的生长环境和葡萄酒的酿制工艺等原因，经常会造成赭曲霉毒素（OTA）的污染。刘青[1]等对9个国家中的11种不同种类的葡萄酒进行筛查，发现OTA的检出率高达45.4%，检出浓度为1.1～11.5μg/L，有4个样本超过2μg/L。Patricia[2]等从葡萄酒中检出黄曲霉毒素，其中黄曲霉毒素B2（AFB2）含量超过葡萄牙法规规定。基于此，本文开发了一种可同时测定葡萄酒中八种真菌毒素的方法，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2、展青霉素、呕吐毒素、赭曲霉毒素A以及玉米赤霉烯酮。本文利用UHPLC-MS/MS建立了葡萄酒中8种真菌毒素的检测方法。对质谱条件进行优化，正负电喷雾离子模式进行质谱检测，多反映监测（MRM）模式采集，寻找母离子和子离子，对碰撞能量进行优化，同时调谐各仪器参数至最佳，最后对液相方法进行优化。待仪器方法优化完毕，再基于QuEChERS方法对前处理的样水体积比、盐添加量及种类、净化剂选择进行优化，最后将建立好的方法经验证后用于实际样品的测定[3]~[5]。2材料与方法2.1实验材料与试剂乙腈、甲醇和甲酸均为色谱纯，甲酸铵、乙酸钠、无水硫酸镁和无水柠檬酸均为分析纯。葡萄酒购自昌黎本地。在氯化钠和硫酸镁存在的条件下，采用乙腈对样品进行初步提取。采用旋转蒸发法对得到的提取物进行浓缩，然后进行复溶，再利用超高效液相色谱(UHPLC)三重四极杆质谱多反应模式(MRM)检测。2.2实验仪器与设备超高效液相色谱（CBM-20A，日本岛津）-三重四级杆串联质谱仪（TRIPLEQUADTM5500，美国AB）、ME204T电子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）、NP-30S漩涡混合器（常州恩培仪器制造有限公司）、摩尔元素型Molecular1815d超纯水机（重庆摩尔水处理设备有限公司）、Velocity14离心机（英国Dynamica）、旋转蒸发仪（德国heidolph）、、SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、恒温恒湿培养箱（常州金坛良友仪器有限公司）。色谱条件色谱柱：Atlantis®T3（2.1×150mm，3μm）；柱温30℃；进样量20μL；流速0.2mL/min；流动相A为1‰甲酸水（含0.5mmoL甲酸铵），B为乙腈；洗脱条件见表1。表1色谱梯度洗脱条件Table1Chromatographicgradientelutionconditions时间/min流速/(mL/min)流动相A/%流动相B/%0.010.2356520.2356550.295590.2955110.23565质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正负离子扫描。检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压（IS）：5500V/-4500V；雾化器压力（GSI）：30Psi；气帘气压力（CUR）：30Psi；辅助气压力（GS2）：30Psi；离子源温度：500℃。2.3实验方法2.3.1样品前处理准确移取5mL葡萄酒样品于50mL具塞离心管中，加入40mL乙腈、1g醋酸钠和4g无水硫酸镁。漩涡震荡3min使其混匀，8000r﹒min-1下离心10min，取出上清液。残渣重复以上步骤，合并上清液，40℃下旋转蒸发，剩余物质用乙腈-水（30+60）溶液2mL复溶，溶液过有机微孔滤膜（0.22μm）后，仪器分析测定。2.3.2基质效应试验分别将不含目标待测物的红葡萄酒和白葡萄酒样品经上述前处理后作为基质空白，以基质空白为溶剂配置基质标准曲线，将基质标准曲线和纯溶剂配制标准曲线对比，来判定葡萄酒基质对目标真菌毒素的增强或抑制作用。图1基质效应评估结果2.2.3标准溶液的配制根据不同真菌毒素在有机试剂中的溶解度配置标准储备液，各自的储备液浓度如表3所示。单一储备液与混合储备液均保存在-24℃。表2真菌毒素溶剂、储备液及混合储备液浓度Table2Concentrationofmycotoxinsolventreservesolutionandmixedreservesolution标准品名称溶剂储备液浓度(mg/L)混合储备液浓度(μg/L)AFB1ACN0.110AFB2ACN0.110AFG1ACN0.110AFG2ACN0.110DONACN100100OTAACN:MeOH/1:12100PATACN1100ZENACN21002.3.4线性范围、检出限（LOD）及定量限（LOQ）向不含目标化合物的基质空白溶液中添加不同浓度的标准溶液，经有机微孔滤膜（0.22μm）过滤后，MRM模式检测，分析添加浓度与响应值的相关性，得到基质曲线。检出限和定量限分别为基质曲线的最低点浓度的3倍和10倍信噪比（S/N）[6]~[10]。2.3.5回收率和精密度实验向空白葡萄酒基质中添加不同浓度的标准溶液，添加量分别为1ng/mL、4ng/mL和10ng/mL。经上述步骤处理、检测后，使用基质曲线定量，计算回收率和精密度。图2回收率和精密度实验色谱图3结果与分析3.1质谱条件的优化本实验采用的是三重四级杆质谱，相比较单四级杆质谱，有更好的定性、定量能力，MRM信噪比高，功能也更加全面。优化质谱方法的过程是全波段扫描出化合物的母离子，并优化碰撞能量。结果显示，黄曲霉毒素在正极模式下灵敏度更高，其余毒素在负极模式下灵敏度更高。因此本方法采用正负极交替模式进行检测。找到母离子后，在选择子离子的过程中调节碰撞能量，从而确定最佳碰撞能量。选择子离子时，根据响应值最优原则，将响应值最高的子离子确定为定量离子，在选择一到两个高响应值的子离子作为定性离子。在具体操作上，配置浓度为50ng/mL的真菌毒素标准溶液，溶剂为50%甲醇水溶液，对其进行质谱扫描，优化质谱参数。确定母离子后，在选择子离子的过程中调节碰撞能量和去簇电压，从而确定最佳碰撞能量。选择子离子时，根据响应值最优原则，将响应值最高的子离子确定为定量离子，在选择一到两个高响应值的子离子作为定性离子[11]~[13]。表3质谱分析参数Table3Analysisparametersofmassspectrometry化合物离子母离子子离子去簇电碰撞能源/(m/z)/(m/z)压/V量/eVAFB1ESI+313.3285.1*，241.1199，19130，47AFB2ESI+315.3287.1*，259.1172，18733，37AFG1ESI+329.3311.2*，243.3169，16228，34AFG2ESI+331.2313.2*，245.2143，16331，38DONESI-295.1265.2*，138.0-90-24，-14OTAESI-402.3358.1*，210.9，166.9-120-26，-37，-46PATESI-152.996.1*，79.9-71，-51-55，-40ZENESI-317.1131.1*，174.9-143-34注：*为定量离子3.2流动相的选择为提高化合物的的响应值，通常会向流动相中添加挥发性酸和缓冲盐体系。少量的有机酸还能改善峰型。本实验分别采用乙腈-水体系、乙腈-1‰甲酸水体系、乙腈-超纯水（0.5mmoL甲酸铵）体系、乙腈-1‰甲酸水（0.5mmoL甲酸铵）、甲醇-超纯水体系、甲醇-1‰甲酸水体系、甲醇-超纯水（0.5mmoL甲酸铵）体系、甲醇-1‰甲酸水（0.5mmoL甲酸铵）体系进行对比，发现当使用甲醇作为有机相的流动相时，离子丰度低，OTA、PAT出现拖尾情况，且DON响应值极低。使用乙腈作为流动相时响应值明显提高，且洗脱时间变快、拖尾状况消失。甲酸的加入可以有效改善峰型，甲酸铵的加入可以使基线分离，消除拖尾。考虑到仪器维护及清理的问题，甲酸和甲酸铵均添加在超纯水中。因此选用乙腈-1‰甲酸（0.5mmoL甲酸铵）体系。3.3QuEChERS方法优化葡萄酒中水分会影响真菌毒素在有机相和水相中的分配，且无法利用旋蒸完全去除，因此采用基于QuEChERS用盐类浸提的方法来促进真菌毒素的提取并除去水分。本实验采用QuEChERS推荐的醋酸钠和无水硫酸镁组合进行研究发现，在加入一定量的醋酸钠后，真菌毒素的回收率会随着后续加入的无水硫酸镁的质量呈现先增加后减少的情况。可能原因为无水硫酸镁与水相剧烈反应放出大量的热从而造成了真菌毒素的损失[14]。而在加入定量的无水硫酸镁后，改变醋酸钠的用量对真菌毒素的回收率并无明显影响。推测为醋酸钠的加入使得有机相和水相分离更加彻底，无水醋酸钠的加入能够吸收水分从而促进真菌毒素像有机相转移。综合考虑后选择0.5g醋酸钠和2g无水硫酸镁作为最优添加量。表4不同质量无水硫酸镁添加量下真菌毒素回收率Table4Recoveryratesofmycotoxinunderdifferentamountsofanhydrousmagnesiumsulfate真菌毒素回收率（%）1g2g3g4g5gAFFB270104746049AFG16789664838AFG27894796451DON85102868778OTA9096827367PAT88876541333.4前处理方法的优化葡萄酒为液体，样品与溶剂的体积比会对提取效率产生显著的影响。在样品中添加10ng/mL的真菌毒素混合标准溶液，并以2、3、5、8、10倍葡萄酒样品体积的乙腈作为前处理提取液，经UHPLC-MS/MS测定后，将所得峰面积进行比较，回收率结果如表5所示。多数真菌毒素回收率随体积比的增加而增加，当达到8倍体积比时，八种真菌毒素的回收率达到最高。继续增加乙腈用量，回收率不会继续上升。本实验选取C18和PSA固相萃取填充料对葡萄酒样品进行净化处理后发现，使用C18作为吸附剂时，OTA和AFG2回收率明显降低。使用PSA吸附，AFB1无响应。同时串联两种填充料时会造成标准品极大的损失。综合效率及成本等方面，本实验选择直接用乙腈提取上样。表5不同体积比下真菌毒素回收率Table5Recoveryratesofmycotoxinatdifferentvolumeratios真菌毒素回收率（%）2:13:15:18:110:1AFFB277113889180AFG161591228381AFG25359778579DON44726987106OTA61728095123PAT67788296118ZEN827710297109表6不同净化剂对真菌毒素回收率的影响Table6Effectsofdifferentpurificationagentsontherecoveryofmycotoxin真菌毒素回收率（%）C18PSAC18+PSAAFB17900AFB2707765AFG1668135AFG2426946DON768464OTA399220PAT778670ZEN6651493.5基质效应评价基质效应，指待测样品中除被测组分以外的物质对待测组分的干扰。葡萄酒中的脂肪酸、糖类、醇类等均有可能对真菌毒素的含量产生影响。根据葡萄酒酿制工艺与酿酒原料的差异，本实验分别进行了红葡萄酒和白葡萄酒的基质效应试验。将基质曲线与标准曲线对比后发现，绝大多数真菌毒素受到基质效应的影响[15]。因此，定量分析时选用基质曲线既可以提高定量分析准确性又可以保证定性离子的准确性。基质效应计算方式为：基质效应=基质标准曲线斜率/溶剂标准曲线斜率。表7基质效应评估结果Table7Matrixeffectevaluationresults真菌毒素基质标准曲线与溶剂标准曲线斜率比红葡萄酒白葡萄酒AFB10.810.80AFB20.880.89AFG10.750.87AFG20.570.79DON0.890.84OTA1.121.14PAT0.310.37ZEN0.690.63由表9可知，不同品种的葡萄酒均对PAT有明显的抑制作用，对于AFG1、AFG2,红葡萄酒的抑制作用明显，高于白葡萄酒。另外，不同品种的葡萄酒均对OTA有增强作用。3.6准确度与精密度想空白基质葡萄酒中添加三个水平浓度的真菌毒素标准溶液，经计算得到各自浓度的回收率及相对标准偏差（RSD），每个水平加标实验重复进行6次。结果见表8。表88种真菌毒素在不同葡萄酒基质中的回收率和精密度Table8Recoveriesandprecisionof8mycotoxinsindifferentwinesubstrates真菌毒素添加量/（μg·L-1）红葡萄酒白葡萄酒回收率（%）RSD（%）回收率（%）RSD（%）0.194.24.5103.87.2AFB10.496.33.890.56.41101.22.1104.88.70.1104.96.985.77.2AFB20.4102.35.688.26.11101.07.190.13.60.189.48.8105.24.6AFG10.493.84.7110.33.9193.55.2107.94.30.187.96.587.87.1AFG20.488.77.889.24.4189.96.392.33.8186.99.0104.14.7DON485.28.4112.32.21090.17.8107.96.41953.8113.35.2OTA494.11.8115.82.61094.73.291.24.11102.18.589.22.7PAT489.77.688.75.01091.25.490.31.9197.44.894.14.8ZEN489.77.9105.87.110101.46.8103.12.1由上表可知，8种真菌毒素的三水平加标实验回收率为85.7%～115.5%，RSD在2.1%～9.0%之间，可以满足要求，用于食品安全质量检测。3.7实际样品测定自1995年ZimmerliB[98]等报道出葡萄酒中存在OTA后，葡萄酒中真菌毒素污染问题便引起了广泛关注。真菌毒素污染范围广，极易污染粮食作物及其制品、水果蔬菜及其制品、油料作物及其制品、坚果产品、乳制品等多种食物，在食物的种植、采集、加工、运输和储存的过程中都有可能被真菌毒素污染。近年来，不断有葡萄酒被真菌毒素污染的事件曝光。由于真菌毒素毒性强、化学结构稳定、不易分解，会对消费者的健康造成极大的影响。本文对50种昌黎本地产红、白葡萄酒进行真菌毒素检测，以调查昌黎葡萄酒被真菌毒素污染的情况。结果表明，两种红葡萄酒中赭曲霉毒素为阳性。3结论本实验建立了AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、OTA、PAT、ZEN共八种真菌毒素的高效快速检测方法。八倍体积乙腈浸提，加入1g醋酸钠和4g无水硫酸镁，省略萃取净化步骤，提取液经离心、浓缩后直接利用UHPLC-MS/MS进行检测，效果最好。八种真菌毒素的线性相关系数均不小于0.999，ILOD为0.001~0.005μg/L。本方法准确度和精密度良好，在三个不同浓度标品的添加水平下加标回收率为85%~110%，RSD在5.00%~10.00%之间，满足检测要求。采用本方法对昌黎地区50种葡萄酒进行检测，除OTA外，其他真菌毒素均未在葡萄酒中制定限量标准，但其含量都没有超过在其他食品中的最高限量标准。采用Design-Expert10.0软件进行响应面最佳条件优化，确定真菌毒素降解的最佳条件，为食品中真菌毒素的生物防治提供了方向。

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