《木麻黄青枯菌强致病性菌株筛选技术规程》

4DB44/TXXXXX—XXXX木麻黄青枯菌强致病性菌株筛选技术规程本文件规定了木麻黄青枯菌（Ralstoniasolanacearum）分离与纯化、检测鉴定方法、菌株鉴定、强致病性菌株筛选及菌种保存等技术要求。本文件适用于木麻黄属植物强致病性青枯菌菌株的筛选。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，凡是注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.28-2013食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1青枯菌Ralstoniasolanacearum病害英文名：BacterialwiltofCasuarina；属细菌界Bacteria，变形菌门Proteobacteria，β-变形菌纲Betaproteobacteria，伯克氏菌目Burkholderiales，伯克氏菌科Burkholderiaceae，青枯菌属Ralstonia。病原菌通过根部从病株蔓延至健株，通过土壤、水流进行远距离传播。木麻黄青枯菌的其他信息参见附录A。3.2强致病性Strongpathogenicability能让木麻黄植株迅速感病死亡的能力。3.3褐梗小枝Brownlignifiedtwigs基径2mm～5mm的褐色木质化小枝，具多分枝。3.4分枝Branch生长在小枝上的绿色枝条。3.5小苗seedling5DB44/TXXXXX—XXXX无性系苗或实生苗，50cm～70cm高。4原理与方法青枯病菌菌株间存在着显著的致病性差异，且在木麻黄—青枯菌的病理系统中，木麻黄同时存在水平抗性与垂直抗性，利用不同接种方法、不同抗性植物材料与多菌株交互接种测定的方法，才能准确筛选出强致病性菌株。5仪器用具5.1仪器植物生长培养箱、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、电子天平（精度≤0.0001g）、生物显微镜（具照相系统）、超净工作台、高压灭菌锅、高速冷冻离心机(≥12000r/min）、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、离心机、恒温水浴锅（30℃~95℃)、低温冰箱、纯水机、涡旋振荡器、分光光度计、可调微量加样器等。5.2用具镊子、手术剪、解剖刀、量筒、烧杯、培养皿、三角瓶、离心管、试管、接种针、接种环等。6培养基与试剂6.1培养基CPG培养基：按附录B中的B.1规定执行。TTC培养基：按附录B中的B.2规定执行。6.2试剂革兰氏染色试剂：按附录B中的B.3规定执行。PCR检测所需试剂：按附录B中的B.4规定执行。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）7病菌分离与纯化7.1病株判断小枝黄化，稀疏、凋落，枯枝枯梢多；根系发黑腐烂；木质部局部或全部变褐色至黑褐色；树皮常纵裂成溃疡状；坏死根茎有水浸臭味；根、主茎、侧枝横切面伤口有乳白色至黄褐色的细菌脓液溢出。7.2样本采集挖出病根，剪取直径0.5cm～1.5cm、木质部呈水渍状或半透明状主根或侧根2段～3段，每段10cm~20cm，封口袋封装，记录采集时间、地点，带回实验室分离病菌。7.3病菌分离6DB44/TXXXXX—XXXX7.3.1稀释分离法取病根（约3cm），自来水洗净，75％的酒精浸泡消毒30s，置无菌水冲洗3次，每次30s，在超净工作台上剥去外皮，置于无菌培养皿中切除两端，最后将其横切成3份～5份，放入含有5ml～10ml无菌水的培养皿内30min，搅拌形成病菌悬浮液。用接种环蘸取菌液在TTC培养基平板上划线分离，至少3个平板，编号，于30℃下恒温培养24h～48h。7.3.2根系溢出法将8cm～10cm长的病根洗净，两端切成平整的新鲜断面，把其中一端浸泡于装有无菌水中的玻璃瓶中，室温放置12h～36h后，在病根的另一端断面会流出乳白色的菌脓。用接种针挑取菌脓划线培养于TTC培养基平板上，至少3个平板，编号，置于30℃下恒温培养24h～48h。7.4病菌纯化在培养皿内挑取不规则圆形，乳白色、中心部位粉红色，具有流动性的单菌落，接种于TTC培养基平板上，30℃条件下扩大培养36h～48h，每个菌落接种3个培养皿并编号。7.5病菌培养7.5.1固体培养接种于TTC或CPG固体培养基中，30℃条件下培养24h～48h。7.5.2液体悬浮培养将分离纯化后的青枯病菌接种于三角瓶中，CPG液体培养基振荡培养，液体培养基体积不超过三角瓶容积的1/2，150r/min～200r/min，30℃条件下培养12h～24h。8检测鉴定8.1菌落特征在TTC固体培养基平板上菌落呈不规则圆形，略隆起，白色或乳白色，中心部位淡红色或粉红色（有的中央部位出现螺旋样红色沉着），不透明，具有流动性。8.2形态特征青枯菌菌体呈短杆状，两端钝圆，大小为（1.5μm～2.5μm）×（0.5μm～0.7μm），多数无鞭毛，少数具1根～3根极生鞭毛，无芽胞，无荚膜。8.3革兰氏染色按GB4789.28-2013中的方法进行革兰氏染色反应。若革兰氏染色呈阴性，则进行下一步检测。8.416SrRNA测序鉴定从分离的菌株中提取DNA作为模板，PCR扩增青枯菌16SrRNA基因片段，以无菌双蒸水模板做为空白对照，用已知青枯菌菌株DNA做阳性对照，扩增目的片段大小约为280bp。PCR产物回收后测序、比对，具体检测方法步骤按附录B中的B.4规定执行。8.5LAMP快速检测7DB44/TXXXXX—XXXX（5-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3）和B3（5-ACCGCAACACGGGATCA-3）为外侧引物，FIP（5-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3）和BIP（5-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3）为内侧引物。LAMP反应结束后对扩增产物进行检测，具体检测方法步骤按附录B中的B.5规定执行。8.6致病性测定8.6.1褐梗小枝水培接种材料选择对青枯病抗性具有差异的木麻黄无性系，如A13与K18（感病），G1与30（抗病）等。方法恒温水培接种法，具体操作方法按附录B中的B.6规定执行。相对病害强度分级标准相对病害强度分级标准如下：a)0级：分枝无症状，级数值为0；b)1级：分枝萎蔫下垂，保持绿色，级数值为1；c)2级：分枝枯黄、萎蔫下垂，级数值为2；d)3级：分枝干枯死亡，级数值为3。病情指数病情指数是全面考虑发病率与严重度的综合指标。病情指数按式（1）计算。……（1）式中：ID——病情指数；Ni——各级病级分枝数；Gi——各级病级相应级数值；Gk——最高级数值；Nt——调查总分枝数。8.6.2小苗盆栽接种材料选择对青枯病抗性具有差异的木麻黄无性系，如A13与K18（感病），G1与30（抗病）等。方法移栽浸根接种法，具体操作方法按附录B中的B.7规定执行。8DB44/TXXXXX—XXXX死亡率计算以株为单位调查，记录无病植株与死亡植株数。死亡率按式（2）计算。%……（2）式中：P——死亡率；D——死亡植株数，单位为株；N——调查总株数，单位为株。9菌株鉴定分离纯化得到的细菌菌株符合以下几方面的检测结果，则可以判定为青枯菌菌株。a）在TTC半选择性培养基上的菌落特征与描述相符。b）革兰氏染色反应呈阴性。c）PCR扩增产物测序结果与已知的Ralstoniasolanacearum16SrRNA基因序列同源性达99%以上或经LAMP快速检测，反应结束后反应管中反应液呈现绿色。10强致病性菌株筛选符合以下两个方面的检测结果，则可以判定为青枯菌强致病性菌株。a）褐梗小枝水培接种法，参试植物材料的病情指数均在70以上。b）小苗盆栽接种参试植物材料死亡率均在70%以上。11菌种保存11.1蒸馏水保存法将分离纯化后的病原菌放入盛有灭菌蒸馏水的试管中，控制菌的浓度约107–8cfu/ml，加塞放入4℃恒温冰箱中临时保存，保存时间不超过1周。11.2甘油液保存法将纯甘油配制成50%的水溶液，高压灭菌后置于-20℃冰箱待用。保存菌种时将50%甘油与菌液按2:1比例混合，剧烈震荡，充分混匀，置-20℃至-80℃可保存3年左右。11.3液氮超低温保存法将冰浴过的青枯菌菌悬液分装到冷冻管内，套上热收缩塑料管，加热，并使之完全密封。将密封好的冷冻管快速在液氮中冷冻，再将冷冻过的冷冻管放入液氮罐的格子内保存，经常注意补充液氮，可保存10年以上。11.4冷冻干燥保存法9DB44/TXXXXX—XXXX在培养皿中分离纯化好菌种后，加入高压灭菌过的保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起，制成菌悬液。将菌悬液分装于安瓿管中，在-80℃冰箱预冻1h～2h，再将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机内开始冷冻干燥8h～20h，可保存10年以上。DB44/TXXXXX—XXXX（资料性）木麻黄青枯菌A.1地理分布亚洲、欧洲、非洲、北美洲、南美洲均有分布；我国主要分布于福建、广东、广西、海南、浙江、江苏、湖北、湖南、江西、云南、贵州、四川、重庆、山东、河南、河北、安徽、北京、天津、上海、台湾。A.2寄主范围该病菌可侵染茄科、豆科、芭蕉科等54个科的450余种植物，主要有：木麻黄、桉树、番茄、马铃薯、茄子、烟草、香蕉、海里康、桑树、龙葵、辣椒、花生、芝麻、甘薯、油橄榄和姜等。A.3病株症状植株感染青枯菌后，小枝黄化，稀疏、凋落，枯枝枯梢多，根系发黑腐烂，木质部局部或全部变褐色至黑褐色，树皮常纵裂成溃疡状，坏死根茎有水浸臭味，根、主茎、侧枝横切面伤口有乳白色至黄褐色的细菌脓液溢出。A.4病原菌形态特征生物学特性病菌呈短杆状，两端钝圆，大小为（1.5μm～2.5μm）×（0.5μm～0.7μm），多数无鞭毛，少数具1根～3根极生鞭毛，无芽胞，无荚膜，革兰氏阴性菌。病菌从植物根系或受伤部位侵入木质部的维管束，并在维管束中大量繁殖并迅速扩散至整个植株，产生大量胞外多糖、细胞壁降解酶等物质，堵塞维管束中的液流运输，破坏导管组织，从而引起植物萎蔫死亡。A.5木麻黄青枯病病害流行规律通常发生在台风暴雨后，造成大量树木死亡；积水等低洼地容易导致病害发生；高温干旱季节是病害的高发期。DB44/TXXXXX—XXXX（规范性）培养基及试验方法B.1CPG（Casaminoacid-Peptone-Glucose）培养基蛋白胨10g，酪朊水解物1g，葡萄糖5g，蒸馏水1000ml，琼脂17g（配制液体培养基时不加入琼脂），调节PH至7.0，121℃湿热灭菌20min。B.2TTC选择性培养基蛋白胨10g，酪朊水解物1g，葡萄糖5g，蒸馏水1000ml，琼脂17g，调节PH至7.0，121℃湿热灭菌20min后，温度降至50℃左右，用过滤灭菌方法加入2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）0.05mg/L。B.3革兰氏染色法B.3.1结晶紫染色液结晶紫1.0g，95%乙醇20.0ml，1%草酸铵水溶液80.0ml，将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。B.3.2革兰氏碘液碘1.0g，碘化钾2.0g，蒸馏水300.0ml，将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。B.3.3沙黄复染液沙黄0.25g，95%乙醇10.0ml，蒸馏水90.0ml，将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。B.3.4染色法染色步骤如下：1）将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗；2）滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗，用吸水纸吸去水分；3）滴加95%乙醇脱色，约30s；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。水洗，吸去水分；4）沙黄复染液染1min，自来水冲洗；干燥，镜检；5）被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌（G+菌），染成红色的称为革兰氏阴性菌（G－菌）。B.4PCR检测方法B.4.1细菌DNA模板的制备无菌操作下，将纯化后的待测菌制成菌悬液，或取可疑植物组织，按照细菌基因组DNA抽提试剂盒方法提取基因组DNA，测定DNA浓度，-20℃保存备用。DB44/TXXXXX—XXXXB.4.2引物OLI1：5-GGGGGTAGCTTGCTACCTGCC-3Y2：5-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3B.4.3PCR反应体系体系为25µL：1×PCR缓冲液（20mMTris-HCl，pH8.4，20mMKCl，10mM(NH4)2SO4，1.5mMMgCl2）0.2mM，dNTP0.2mM，引物各1μM，Taq酶1U，模版2μL，加ddH2O至25μL。B.4.4PCR反应条件变性：96℃,2min。三温循环：94℃,20s；68℃,20s；72℃,30s。50个循环后，72℃延伸10min。B.4.5PCR结果判定2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如能观察到280bp左右的PCR产物条带，则可判定为可疑木麻黄细菌性青枯病菌，进一步测序鉴定，否则为阴性。B.4.6测序将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者直接测序（测序可由生物公司完成测序引物为OLI1、Y2。B.4.7比对测序结果与GenBank数据库中已有青枯菌（R.solanacearum）菌株的16SrRNA基因序列进行比对，同源性99%以上时将该病原菌鉴定为青枯菌。B.5LAMP快速检测鉴定B.5.1细菌DNA模板的制备按附件B中的B.4.1规定执行。B.5.2引物设计和合成以青枯菌的lpxC作为检测靶标，利用PrimerExplorerVersion4.0（http://primerexplorer.jp/e/）在线设计4条LAMP特异性引物，其中F3（5-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3）和B3（5-ACCGCAACACGGGATCA-3）为外侧引物，FIP（5-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3）和BIP（5-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3）为内侧引物。B.5.3LAMP反应体系LAMP反应体系设定为25μL：体系中内引物FIP和BIP的浓度分别为1.6μmol·L-1，外引物F3和B3的浓度分别为0.2μmol·L-1，dNTPDB44/TXXXXX—XXXXTris-HCl，10mmol·L-1(NH4)2SO4，50mmol·L-1KCl，6mmol·L-1MgSO4，0.1%Tween-20），模板DNA1μL，然后加入8个单位的Bst2.0DNA聚合酶，补水至25μL。混匀离心后，63℃孵育45min。B.5.4扩增产物检测反应前在PCR管内盖上加入1μLSYBRGreenⅠ荧光染料，反应结束后瞬时离心，将染料与反应液混匀后观察颜色变化，若反应管中有青枯菌DNA的大量扩增，则反应管颜色呈现绿色，反之为橙色。B.6恒温水培接种法B.6.1试验设计无性系与菌株的双因素交叉试验。每个无性系与每个菌株的一次试验为一个处理。B.6.2植物材料15cm～20cm木麻黄褐梗小枝，每个褐梗小枝含有8个～10个分枝。每个处理需要3段～4段褐梗小枝（共包含约30个分枝）。B.6.3菌株经分离纯化、鉴定后的青枯菌菌株作为测定菌株。B.6.4操作方法各处