发酵分析-色谱分析概述

色谱分析第一节色谱法概述一、色谱法的特点、分类和作用

混合物最有效的分离、分析方法。俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。色谱法是一种分离技术，试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。碳酸钙（固定相）色素混合液石油醚

(流动相）1906年，Tsweet

发现色谱分离现象色谱柱色带植物色素分离图示色谱法的特点（1）分离效率高

复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高

可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快

一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广

气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处：

被分离组分的定性较为困难。色谱法的分类1．按两相分子的聚集状态分类流动相固定相类型液相色谱液体固体液-固色谱液体液体液-液色谱气体固体气-固色谱气体液体气-液色谱气相色谱超临界流体色谱法——流动相为超临界流体色谱法分类（续前）2．按固定相的固定方式分类3．按分离机制分类平面色谱

纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱色谱

填充柱色谱毛细管柱色谱

分配色谱吸附色谱离子交换色谱空间排阻色谱毛细管电咏法毛细管电色谱法毛细管电泳二、色谱过程、分离原理及特点㈠色谱过程指被分离组分在两相中的“分配”平衡过程以吸附色谱为例见图示

吸附→解吸→再吸附→再解吸→反复多次洗脱→被测组分分配系数不同→差速迁移→分离图示分配系数的微小差异→吸附能力的微小差异微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出back㈡色谱分离原理色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异平衡分配可以用分配系数和分配比来衡量㈢色谱分离特点

1．不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等→提供了分离的可能性

2．各组分沿柱子扩散分布→峰宽→不利于不同组分分离三、色谱流出曲线与术语1.基线

无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.保留值

（1）时间表示的保留值

保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；

死时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间；

调整保留时间（tR

＇）：tR＇=

tR－tM

（2）用体积表示的保留值

保留体积（VR）：

VR=tR×F0F0为柱出口处的载气流量，单位：mL/min。

死体积（VM）：

VM=

tM×F0

调整保留体积(VR＇)：

V

R＇=VR

－VM

3.区域宽度

用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差(

)：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度Y1/2=2.354

（3）峰底宽(Wb)：Wb=4

四、分配系数与色谱分离㈠分配系数和容量因子：相平衡参数分配系数K(平衡常数)：指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比（色谱过程的相平衡参数）注：K为热力学常数与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关实验条件固定，K仅与组分性质有关五、色谱定性与定量方法1.

色谱定性分析(1)利用保留值及其规律定性各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此保留值可作为定性指标。利用纯物质对照定性利用文献值对照定性纯物质对照定性实现方法利用保留时间定性

用相对保留值定性

用已知物增加峰高法定性

文献值对照定性分析（GC）实现方法测定保留指数I

优点：无需纯物质；保留指数具有较好的重现性和精密度；只与固定相和柱温有关。缺点：对结构复杂的物质，缺乏数据。适用范围：适用于简单混合物，无需纯物质。（2）与其他分析仪器联用的定性方法SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定:

外标法外标法也称为标准曲线法。特点及要求：外标法不使用校正因子，准确性较高操作条件变化对结果准确性影响较大对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析

内标法原理：利用被测物与内标物校正因子的比值不变来进行定量的。首先用被测物标准品和内标物配制标准溶液，求得校正因子比值：然后，样品中加入内标物，再由它和样品的峰面积来计算：

fis＝fi/fs－内标物与被测组份校正因子的比值；

mi－被测组份i的含量；ms－加入内标物的量；As－内标物的峰面积；Ai－组份i的峰面积；(a)内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。(b)每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。内标物要满足以下要求：（a）试样中不含有该物质；（b）与被测组分性质比较接近；（c）不与试样发生化学反应；（d）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰响。内标法特点与外标法比较：1.外标法：2.内标法：可以推导出：思考题色谱分离的原理及过程。第二节薄层层析（Thin-layerchromatography）1、基本原理薄层层析法是色谱分析技术的一种

一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同组分的吸附力不一样，不同组分在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）Thin-LayerChromatography:ATwo-ComponentMixtureMorepolar!Lesspolar!solvent

frontoriginmixturesolvent

frontcomponent

Bcomponent

Aoriginsolvent

frontcomponent

Bcomponent

AoriginIncreasingDevelopmentTimeThin-LayerChromatography:DeterminationofRfValuesRfofcomponentA=dAdSRfofcomponentB=dBdSTheRfvalueisadecimalfraction,generallyonlyreportedtotwodecimalplacesThin-LayerChromatography:QualitativeAnalysis固定相：氧化铝Acidic:-Al-OHNeutral:-Al-OH+-Al-O-Basic:-Al-O-硅胶吸附薄层层析吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶

硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附.硅胶吸附薄层层析的特点：

①硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。②硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。③硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。2、操作步骤

—薄层板的制备

1、调浆称取硅胶3克，加0.5%的羧甲基纤维素钠8毫升，调成均匀的糊状。

2、涂布取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。

3、干燥将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。

4、活化

70℃烘干30分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。展开剂的选择1、位置：用铅笔距底边2cm水平线上均匀确定4个点。每个样品间相距约1cm。2、取样：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高5cm。3、点样：点样毛细管轻轻接触薄层表面点样。加样后原点扩散直径不超过2mm。

AlaArg

GlyMix轻触疾起操作步骤—点样

(a)点状点样(b)条状点样(c)颈部点样(d)沟槽点样半自动点样仪手动点样器操作步骤—

展层、显色AlaArg

GlyMix

将薄层板点样端浸入展层-显色剂，展层-显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端2cm时，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干或在85℃下烘干，即可显出各层斑点。物理显色含有共轭双键的有机物质能吸收紫外光，将分离后的薄层板置于紫外灯下，组分薄层呈现暗色斑；如果采用硅腔GF(或其它含有荧光指示剂的吸附剂)铺成的薄层，在紫外光照射下，整个薄层呈显黄绿色荧光，斑点部分呈现暗色，更为明显。利用蒸气熏显色时，常用的试剂有固体碘、浓氨水、液体溴。进行显色时，把这些易挥发的试剂放置在密闭容器内（例如标本瓶、标本缸、干燥器等），使它们的蒸气充满整个容器，将已展开并已挥发去溶剂的薄层板放入其中，使之显色。化学显色的方式通常有直接喷雾法和浸渍法两种。

化学显色常用的显色剂剂大致可以分为两类，即通用显色剂和专属性显色剂。通用显色剂：对未知化合物的检测，可以考虑先用通用显色剂。这种显色剂是利用它与被测组分的氧化还原反应、脱水反应及酸碱反应等而显色的，常用的有50％的硫酸溶液、酸碱指示剂溶液、5％磷钼酸乙醇溶液、荧光显色剂等。：

结果计算Rf=斑点至原点距离溶剂前缘至原点距离

小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的Ｒｆ值。

根据Ｒｆ值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。薄层色谱扫描仪

定义：纸色谱分离法又称纸层析法，是根据不同物质在两相中的分配系数不同而进行分离的一种微量分离方法。载体——层析纸（滤纸）；固定相——滤纸上的吸湿水分；流动相——有机溶剂（展开剂）。纸色谱思考题简述TLC的操作步骤。概念：离子交换分离法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所发生的交换反应进行分离的方法。（二）离子交换色谱仪器设备简介离子交换全套装置离子交换树脂的结构-网络骨架苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系离子交换树脂结构骨架：接有功能基团，本身是惰性功能基团：连接在骨架上，可与相反离子结合待交换分子：在吸附阶段可与活性离子交换，与骨架上的功能基团结合活性离子：与功能基团所带电荷相反的可移动的离子活性离子为阳离子，称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换活性离子为阴离子，称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换基质电荷基团反离子商品名纤维素—O—CH2——COO-

·Na+CM-纤维素纤维素-O-（CH2）2-N+H（C2H5）2·Cl-DEAE-纤维素聚苯乙烯—————SO3-·

Na+732阳离子树脂

聚苯乙烯——N+（CH2）4·Cl-717阴离子树脂聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备离子交换树脂的形状结构示意图带正电荷多蛋白紧密结合带