质粒的提取和电泳课件

观察昨天实验课的结果1、观察自己组的实验结果：转化平板*培养板在37C培养12-16h卫星菌：培养时间过长2、实验中的难点*制备效率高的感受态细胞重组质粒的鉴定平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞提取的质粒质粒电泳筛选重组质粒重组质粒的进一步酶切鉴定如何鉴定平板上的菌落为含有重组质粒的菌落？平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞提取的质粒质粒电泳筛选重组质粒重组质粒的进一步酶切鉴定小量制备质粒和电泳分析质粒……质粒载体是存在于细菌染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，在宿主细胞内可独立自主复制并赋予宿主细胞一定的遗传性状筛选标记MCS（多克隆位点）复制原点质粒1)培养细菌使质粒扩增；2)收集裂解细菌；3)分离纯化质粒DNA。

质粒提取原理：质粒提取有多种方法，但都包含有3个基本步骤：√去除蛋白质√去除基因组DNA√去除RNA*酚-氯仿抽提法*RNase消化？？？碱裂解法提取质粒的原理原理：1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱性条件下发生变性。2、怎样去除基因组DNA？当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，

染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；3、怎样去除蛋白质？（已经学过）留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后,用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.1)细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.HclPH8.010mmol/LEDTA.Na2PH8.02)细菌裂解液（溶液II）--裂解菌体0.2mol/L

NaOH1%SDS碱裂解法提取质粒试剂：3）中和液（溶液III）----中和NaOH60ml5mol/L醋酸钾11.5ml冰醋酸28.5ml水4）20mg/mlRNase----降解细菌RNA工作浓度30～50

g/ml其他试剂作用和成分同实验一。质粒DNA的制备（1）（细菌的收获：）

取1.5ml工程菌液6,000转/分，离心2min，弃上清。（2）（细菌的裂解：）

加入200

l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌加入200

l细菌裂解液（溶液II），颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。注：粘稠：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。（3）（中和：）加入150

l中和液，上下颠倒混合后置冰上5min，12,000转/分，4℃离心5min。

碱裂解法提取质粒操作步骤（去除蛋白质）

（4）将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25：24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心5min。（5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min，12,000转/分离心5min。（沉淀DNA）（6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，置-20℃沉淀10－15min。上午实验结束（7）12,000转/分离心5min。

弃上清，室温干燥质粒DNA5-10min。（去除RNA）（8）用20

l含RNase的水溶解质粒DNA，轻轻吹打混合。37℃保温10min20

l质粒DNA溶液取出10

l放于另一个离心管中备用剩余10

l用于下一步酶切重组质粒的鉴定平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有或未含有质粒的细胞，却无法区分含有空质粒或重组质粒的细胞提取的质粒质粒电泳筛选重组质粒重组质粒的进一步酶切鉴定质粒的电泳质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋>线性>开环

质粒DNA的存在形式有3种:1、共价闭环DNA:常以超螺旋形式存在2、开环DNA:质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子

3、线性DNA:因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.开环超螺旋线性一、重组质粒的酶切在一微量离心管中加入：1.重组质粒DNA10ul2.10XBufferM2ul3.EcoRI0.5ul4.HindⅢ0.5ul5.去离子水6ul总体积20ul置37℃，45min。琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒的酶切结果取10ul酶切后的质粒加2~3ul电泳上样液，混匀。加入点样孔电泳：100伏，40分钟。注：可将5ul未切的质粒作为对照。质粒电泳空质粒重组质粒重组质粒分子量变大而在电泳中滞后质粒酶切电泳a:酶切前b:酶切后插入片段注：观察质粒的电泳带型分析质粒切不开的原因。4.ＰCR产物与T载体连接3.RT-PCR5.

转化2.提取RNA、电泳实验课总结------基因克隆总结1.

基因组DNA提取、酶切、电泳（1）基因组DNA提取、酶切、电泳建立基因组文库的第一步人类基因组测序的第一步Southernblot的第一步Smear123

（2）RNA的提取、电泳28S18SRT-PCR的第一步，也是目的基因获得的第一步；Northernblot的第一步；注意：RNA提取过程中主要避免RNA酶的污染。（3）

PCR及电泳分析1)获得目的基因的最常用方法；2)可以进行探针标记；3)可以进行基因的定点突变4)PCR酶切片段长度分析（PCR-RFLP）；5)可以定量分析基因含量（realtimePCR）.注