蔗糖酶理论讲授2012813课件

三、实验步骤及原理1、蔗糖酶的提取2、蔗糖酶的纯化3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白质含量测定5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响6、蔗糖酶酶促反应动力学研究7、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量11、蔗糖酶的提取(细胞破壁)自溶法破壁（本实验）干酵母粉溶于蒸馏水乙酸钠乙酸乙酯35℃恒温搅拌40分钟35℃恒温过夜补加蒸馏水搅拌均匀，成糊状离心弃沉淀及脂层E1记录生产厂家和批号用硫酸纸封严（过夜）2E1用稀HAC调pH至4.5乙醇分级(32%乙醇饱和度)Ι离心，取上清乙醇分级(47.5%乙醇饱和度)Ⅱ离心，取沉淀透析磷酸缓冲液5mmol/LpH6.0

过夜离心，取上清E2E2E3DEAE-52离子交换层析E3E4Sephadex-G100凝胶层析

2、蔗糖酶的纯化31.酶的蛋白属性；2.调节酶溶解度的方法；有机溶剂分级沉淀3.根据酶分子大小、形状不同的分离方法；透析、凝胶层析4.根据酶分子电荷性质的分离方法；离子交换层析5.根据酶分子专一性结合的方法;酶的纯化方法42.调节酶溶解度的方法；酶的纯化方法（1）改变离子强度；盐溶/盐析硫酸铵分级沉淀（反抽提法）（2）改变pH或温度；（3）改变介电常数；有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。5

有机溶剂分级沉淀操作条件的控制

溶剂选择常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。温度使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。样品浓度的控制

一般认为蛋白质的初始浓度为0.5%-2%为好。64.根据酶分子电荷性质的分离方法；酶的纯化方法离子交换层析基本原理：

以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。在介质中带正电的物质用阳离子交换剂；带负电物质用阴离子交换剂93、蔗糖酶的活性测定酶活力

(enzymeactivity)酶催化某一反应的能力——VV——单位时间内单位体积中

底物(substrate)

的减少量或

产物(product)

的增加量10国际单位（IU）：在特定的条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量。催量单位（kat）：在特定条件下，每秒钟使1mol底物转化为产物所需的酶量。1IU=16.67×10-9kat

酶活力单位：2、酶活力和比活力表示方式11活力

(或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活力是酶纯度的量度，是每毫克酶的催化活力数(U/mg蛋白)。在酶的纯化过程中它的比活力逐渐升高，当酶提纯时，其比活力值成为最大和恒定。酶的比活力(specificactivity，也称比活性）比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示。比活力=酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）比活力有时也可用每g或每ml酶含多少个活力单位来表示12

DNS法测定蔗糖酶活力（本实验）1、3,5-二硝基水杨酸比色定糖的原理：

DNS试剂+

D-葡萄糖氨基化合物

（还原糖）强碱性溶液

沸水浴（棕红色）2）在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。1）2、蔗糖酶活力测定的原理：1）蔗糖酶催化的反应是：

2）蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫克还原糖所需的酶量定义为一个活力单位。(附1)3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。蔗糖D-果糖+

D-葡萄糖蔗糖酶13

3、DNS比色定糖法工作曲线的制作：①取8支血糖管编号1-8，按下页表中的顺序和数量加入葡萄糖标准溶液（2mg/ml）、蒸馏水、3,5-二硝基水杨酸试剂，混匀后同时放入沸水浴中准确反应5分钟（注意：一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管，且不要用大烧杯代替沸水浴锅），取出后立即用流动的冷水冷却，加蒸馏水定容至25ml，摇匀，测定540nm处的吸光度值。②以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A540值为纵坐标，画出工作曲线。14蔗糖酶活力的测定：操作：①取两支试管分别加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸缓冲液适当稀释过的酶液

2ml，一支中加入0.5ml

1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活（做对照），另一支做测定管；把两支试管和5%的蔗糖溶液放入35℃水浴中预热恒温；分别取2ml5%的蔗糖加入上述两试管中，并准确计算时间，3分钟后于测定管中加入

0.5ml1mol/L的NaOH，摇匀，终止反应。②从反应混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml3,5二硝基水扬酸试剂和1.5ml水，摇匀。于沸水浴中准确反应5min，立即用冷水冷却，加水稀释至25ml，摇匀，于540nm处测光密度。在葡萄糖标准曲线上找到所测定光密度值对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力：

[E]=(葡萄糖mg数×(4.5/0.5)×E的稀释倍数/2ml)/215紫外吸收法双缩脲法Folin-酚法(Lowry法)4、蔗糖酶的蛋白浓度测定16这是测定蛋白质含量最灵敏的经典方法之一，由于方法简便，灵敏度高，常为实验室所采用，也是文献上用得最多的方法之一。

Folin-酚法(Lowry法)

(A)凡含有两个及两个以上肽键(-CO-NH-)的化合物在碱性溶液中(如Folin-甲试剂)都能与Cu2+作用，形成紫色的复合物；(B)所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应形成紫色的铜-蛋白质复合物；(C)铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸(Folin-乙试剂)还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅(在一定范围内)与蛋白质的含量成正比。干扰物质与双缩脲法相同，而且受它们的影响更大。（附2）原理:17三种蛋白质测定方法比较18正交试验设计(Orthogonalexperimentaldesign)

是研究多因素多水平的一种设计方法，它是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表。5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响196、蔗糖酶酶促反应动力学研究

酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素的科学，是酶工程研究中的一个重要内容。201、影响酶促反应速度的因素

pH值温度酶浓度底物浓度激活剂抑制剂21

2、酶促反应动力学方程式——米氏学说[S]：底物浓度Ｋm：米氏常数Vmax：最大反应速度V：不同[S]时的反应速度MichaelisLandMentenML.,.BiochemZ.1913,49:333–369.22米氏常数（Km）的意义

Km值是酶的特征常数之一，只跟酶的性质有关，而与酶的浓度无关。

Km值作为常数只是对一定的底物、一定的pH、一定的温度条件而言，测定酶的Km值可以作为鉴别酶的一种手段。

1/Km可以表示酶对底物亲和力的大小,1/Km越大,表明亲和力越大,多底物酶有不同的Km值,最适底物的Km值最小。233、抑制剂对酶活性的影响使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。

酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：

在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。24

抑制剂的作用方式

不可逆抑制抑制剂与酶反应中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。可逆抑制

抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为两类（竞争性抑制和非竞争性抑制)25

可逆抑制(1)竟争性抑制某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。

加入竞争性抑制剂后，Km变大，酶促反应Vmax不变。26酶可同时与底物及抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降。由于这类物质并不是与底物竞争与酶活性中心结合，所以称为非竞争性抑制剂。如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。加入非竞争性抑制剂后，Km不变，但由于Vmax减小，所以酶促反应速度也下降了。

可逆抑制(1)非竟争性抑制275、蔗糖酶米氏常数的测定（本实验）1）将离子交换柱层析得的E3稀释(pH4.6HAC缓冲液)至30U/mL，共16ml。2）取试管8支，按0—7编号，0为对照管。3）按P146页表将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35℃水浴中保温（使温度平衡，以下同）10min。4）取16ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。5）于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液2ml，记时，立即摇匀。在35℃水浴中准确反应3min。6）按同样次序和时间间隔，加入0.5ml的1mol/LNaOH，摇匀，终止反应。7）吸取反应混合物0.5ml，加入盛有3mlDNS试剂和1.5ml去离子水的血糖管中，放入沸水中加热5min，冷却后稀释定容至25ml，摇匀后，测定A540值287、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳SodiumDodecylSulfate,PolyacrylamidGelElectrophoresis,SDS29电泳：是指带电粒子在电场的作用下，发生定向泳动的现象。电泳技术：指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。电泳？30蛋白质分子状态在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有一定净电荷的分子,在电场下向自身电荷相反的方向移动。313.按比例配好分离胶,用移液枪快速加入，距梳齿下缘约1cm，之后加少许蒸馏水，静置直到胶与水层间出现清晰界面。※加速剂TEMED要在注胶前加入，否则凝结无法注胶。※注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。※水封的目的是为了使分离胶胶面平整，并排除气泡。※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。4