研究生实验二课件

实验二、ELISPOT

—单细胞分析技术基础医学院免疫学教研室徐琦副教授ELISPOT简介ELISPOT是在ELISA技术的基础上建立的体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术。

可在单细胞水平检测和计数特异性分泌抗体和细胞因子的细胞，并具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用。ELISPOT技术的发展ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky等人率先在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。早期ELISPOT的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题无法解决。直到1996年PVDF薄膜的应用（Forsthuberetal.,Science,1996），才解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高ELISPOTCytokine分析的敏感度。

1996年以来随着抗体制备、PVDF膜等技术改良，ELISPOT分析技术已经逐渐达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特异性T细胞的体外检测技术。ELISPOT与ELISA的比较它们最大的不同在于：

1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。2.ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率;3.由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。

4.刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

106抗原呈递细胞（APC）中混入特定数量的IFN-γ+的T淋巴细胞，经下列方法检测：

ELISPOT

细胞内细胞因子染色（FACS）

ELISAX坐标：106APC中实际IFN-γ+T细胞数量Y坐标：各检测方法的检测结果ELISPOT/FACS/ELISA检测精确度比较BDELISPOT原理1.ELISPOT实验设计是在96微孔培养板底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodiumazide、内毒素endotoxin）的单株抗体。2.静脉血PBMC经适当分离处理后分配到微孔上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。一般而言，记忆性T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞因子，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。3.微孔板中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞因子可进一步使用生物素（Biotin）标记的一抗来标识，其后再与辣根过氧化物酶标记的亲合素作用，并加入底物使其呈色，有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点。BDELISPOT流程1．针对被分析物的捕获抗体包被在贴有PVDF膜的微孔板上2．用完全培养基将板底封闭3．细胞悬液加入Ag或有丝分裂素等刺激剂孵育一定时间以激活细胞――细胞分泌的蛋白紧靠在细胞周围，与已固定的捕获抗体结合4．孵育一定时间后洗去细胞,分泌出的细胞因子会被PVDF薄膜上特异抗体捕获BDELISPOT流程5．加入生物素标记的针对被分析物的检测抗体――检测抗体与被分析物结合，形成‘夹心三明治’复合物6．加入与辣根过氧化物酶(HRP)连接的亲和素――亲和素与检测抗体上的生物素结合7.加入底物与酶发生显色反应，监测颜色斑点的形成，终止底物反应，室温风干，避光保存于封口塑料袋中直至分析颜色斑点BDELISPOT流程CoatingAb包被培养板0.05%PBS-Tween20(PBST)洗板5次每孔加入1%BSA阻断按实验设计加入含或不含刺激剂的培养液及一定数目细胞孵育5-24小时40C过夜370C孵育1小时取外周血单核细胞或脾淋巴细胞根据实验要求，培养液中加入所需刺激物，预先将所检测细胞孵育24-42小时无菌直接取外周血单核细胞或脾淋巴细胞或者BDELISPOT基本流程去除细胞，加入冰冻去离子水200ul/孔，培养板置冰上10分钟加入生物素标记的detectorAb加入酶标抗生物素抗体(GABA)40C暗处混合显色剂I和II,加入显色剂I/II,暗处室温孵育20-30分钟PBST洗板10次370C孵育1小时后，PBST洗板5次370C孵育1小时后，PBST洗板5次显微镜下观察至斑点形成，去离子水清洗培养板室温干燥后在倒置显微镜下观察结果非无菌ELISPOT结果显示ELISPOT结果显示Blankcontrols:G1-9:无刺激剂的细胞H1-9:无细胞的刺激剂样本孔出现颜色斑点Usu.10～20mmBDELISPOT结果分析

在显微镜下计数，一个斑点代表一个分泌细胞用ElispotReader进行分析对斑点自动计数，并做出不同大小斑点的分布图，快速、精确、还能平衡背景信号。软件自动计算出细胞的分泌频率

BDELISPOT操作注意事项11.操作时注意不要触及PVDF膜的底部。2.为获得优化的实验结果，在第一次实验时可使用不同的细胞浓度（103~106cells/microwell)。3.在细胞培养过程中不要摇动ELISPOT板，防止斑点模糊。4.在培养箱孵育过程中，不要将ELISPOT板重叠，防止边缘效应。5.背景过高的克服方法：增加洗涤的次数。在显色之前用PBS洗涤以去除Tween-20，防止对显色的干扰。如果需要,增加干燥ELISPOT板的时间。彻底洗去细胞减少非特异性斑点。掌握好显色时间，防止过度显色。6.实验结束后将ELISPOT板室温晾干，不能高于37℃防止损坏PVDF膜。7.待ELISPOT板干燥后，将其保存在密封的塑料袋中防止褪色。BDELISPOT操作注意事项2ChampSpotⅡ酶联斑点分析系统简介

Bioreader3000TMPRO酶联斑点自动图象分析仪适用于分析：酶联斑点(Elispot)克隆形成（CFU）病毒斑德国Biosys公司产品ELISPOT酶联斑点分析软件和ELISPOT计数分析软件

1、完成整块板的计数只需5个步骤。

2、整块板的采集、分析、数据保存、输出，在15分钟内完成

3、强大的斑点处理功能

4、图象自动修复：可自动减切修复每个孔的内圈图象，有效的区分了孔壁与孔底的连接处。

5、具有单、双、多色斑点分析功能。

6、分析模式：给用户提供全自动、半自动、手动三种分析模式，同时可任意指定对整块ELISPOT板、列、行或单个微孔进行分析。

ELISPOT酶联斑点分析软件和ELISPOT计数分析软件7、单个孔的图片或整块板的图片都可直接，复制或导入到Photoshop、PowerPoint、Word、等软件中进行编辑，同时可将图片转