生物制药技术2-基因构建课件

生物制药技术朱俊铭2016-3-71《生物制药技术（含实验）》课程教学大纲2生物制药研发的基本流程3基因构建发酵培养分离纯化制剂研究质量研究中试放大稳定性研究药效学研究安全药理研究临床申报药学(实验室)药学(中试)药理学临床试验2.1基因与工程细胞构建2.2工程细胞的发酵培养与蛋白表达2.3重组蛋白的分离纯化2.4生物制药的制剂研究2.5生物制药的质量研究与分析技术2.6生物制药的中试研究2.7生物制药的稳定性研究第二章重组蛋白药物的药学概论原核细胞真核细胞42.1.1基本概念2.1.2质粒、载体2.1.3工程细胞与细胞库2.1.4表达方式选择2.1.5基因构建与诱导表达2.1.6实例2.1基因与工程细胞构建5第二章重组蛋白药物的药学概论2.1

基因与工程细胞构建基因重组——分子水平、提取、连接、转染、复制、表达别称——基因工程、DNA重组、遗传工程、基因操作、克隆工程细胞的三要素基因载体宿主细胞62.1.1基本概念2.1.2质粒、载体2.1

基因与工程细胞构建92.1

基因与工程细胞构建102.1

基因与工程细胞构建11克隆鉴定宿主细胞细胞筛选细胞库合成、分离、RT-PCR优化、测序抗性基因、限制性内切酶位点宿主与产品的相关性表达水平、产品鉴定三级细胞库、遗传稳定性载体2.1

基因与工程细胞构建122.1.3工程细胞与细胞库原始种子库主种子库工作种子库2.1

基因与工程细胞构建13调控调控生物遗传中心法则DNARNAProtein2.1

基因与工程细胞构建14蛋白质结构PrimaryStructure——ThesequenceofaminoacidsonthepolypeptidechainSecondaryStructure——Conformationofthepolypeptidechain(3Dstructure)TertiaryStructure——ThreeDimensionalStructure(Folding)oftheproteinQuaternaryStructure——Complexationwithotherproteins(Similarordissimilarstructures)2.1基因与工程细胞构建152.1.4表达方式选择依赖于制备过程的蛋白质结构Prokaryoticcells

EasiertomakeCheapertoproduceImproperfoldingofproteinNoglycosylationNoSecretionEukaryoticcells

CanproperlyfoldtheproteinGlycosylate-(maybedifferently)HardertocloneHardertomaintainincellcultureMayharborviruses

LoweryieldsHigherexpense2.1基因与工程细胞构建162.1.4表达方式选择2.1.5基因构建与诱导表达2.1基因与工程细胞构建172.1基因与工程细胞构建182.1.5基因构建与诱导表达SolubleInclusionBodySecreting2.1

基因与工程细胞构建原核细胞表达系统192.1.5基因构建与诱导表达优点突出正确指导蛋白质正确折叠提供糖基化等多种翻译后加工在新基因发现、蛋白质结构功能研究中起极为重要的作用生产阶段系统表达水平达到7g/L生物医药产业发达国家新药研发中均选择哺乳动物细胞表达系统2.1基因与工程细胞构建哺乳动物细胞表达系统202.1.5基因构建与诱导表达正常细胞生长特性锚地依赖性血清依赖性接触抑制性形态依赖性体外培养正常细胞改变某些特征，越过生理临界点，继续无限制分裂——细胞系形成2.1基因与工程细胞构建哺乳动物细胞表达系统212.1.5基因构建与诱导表达哺乳动物细胞表达系统受体细胞条件细胞系特征——丧失细胞接触抑制和锚地依赖性遗传稳定性——外源基因多次传代不丢失合适的标记——便于筛选与维持生长快且齐——分裂周期短，生长均一安全性——不合成、分泌致病物质，不致癌以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞必须条件2.1基因与工程细胞构建222.1.5基因构建与诱导表达遗传标记哺乳动物细胞表达系统2.1

基因与工程细胞构建232.1.5基因构建与诱导表达常用宿主细胞商业化CHO——中国仓鼠卵巢细胞系BHK——小仓鼠肾细胞系COS——非洲绿猴肾成纤维细胞系NSO——小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0——小鼠骨髓瘤细胞系HEK293——人胚肾细胞系NIH313——鼠成纤维细胞系因稳定性与糖基化不同，根据表达目的蛋白选择适当细胞系哺乳动物细胞表达系统2.1

基因与工程细胞构建242.1.5基因构建与诱导表达真核表达载体必要原件高活性启动子、转录终止序列、有效mRNA翻译信号复制子、抗生素抗性基因、限制性酶切位点标志基因内含子内部核糖体进入位点（IRES）哺乳动物细胞表达系统2.1

基因与工程细胞构建

一般真核mRNA的翻译都需要5'帽子来介导核糖体结合，但真核生物和病毒中还存在一些例外情况，例如一些基因5'端具有一段较短的RNA序列（约150-250bp），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译，这段非翻译RNA被称为内部核糖体进入位点序列（Internalribosomeentrysite,IRES）252.1.5基因构建与诱导表达诱导的方式IPTG/乳糖低温pH低磷表达检测方式表达标志物电泳GFP遗传稳定性基因稳定性——琼脂糖电泳、指纹图谱、PCR、测序表达稳定性——表达标志物、活性四环素蜕皮激素他可莫斯/雷帕霉素RU4862.1

基因与工程细胞构建262.1.5基因构建与诱导表达高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因DHFR-MTX高效表达系统哺乳动物细胞表达系统2.1

基因与工程细胞构建272.1.5基因构建与诱导表达组织纤溶酶原激活剂第一个重组哺乳动物细胞规模化生产的溶栓药物——人组织纤溶酶原激活剂(tPA)目前市场上销售的阿替普酶(tPA)采用DHFR-MTX系统表达，受体细胞为CHO系统人tPA也可由大肠杆菌生产，但蛋白折叠效率低2.1

基因与工程细胞构建282.1.6实例组织纤溶酶原激活剂2.1基因与工程细胞构建292.1.6实例组织纤溶酶原激活剂2.1基因与工程细胞构建302.1.6实例tPArPA

527个氨基酸分子量65kD缺失突变

355个氨基酸

分子量39kDKringleⅡ、丝氨酸蛋白酶区Finger区、KringleⅠ、KringleⅡ、EGF区、丝氨酸蛋白酶区2.1

基因与工程细胞构建组织纤溶酶原激活剂312.1.6实例2.1基因与工程细胞构建组织纤溶酶原激活剂322.1.6实例载体：pET-44a宿主