基因工程原理第四章课件

第四章载体载体(Vector)为什么要有载体？外源DNA转入宿主细胞后常常不能稳定复制载体是什么？可以在宿主细胞内稳定复制的DNA载体实现稳定复制的方式1）作为独立的复制子进行复制质粒、噬菌体2）可以重组到宿主染色体DNA进行复制真核载体：酵母、病毒第一节

大肠杆菌质粒载体质粒原核生物染色体外的稳定复制体,因此可利用作为克隆载体。有时，也泛指所有的环状载体DNA。质粒在琼脂糖电泳时，常呈三条带，迁移快慢从快到慢依次是：超螺旋、线性、开环。质粒的分类按是否携带促进细菌接合的转移基因(tra基因)，分为接合型和非接合型按在单个细胞内的拷贝数，分为松弛型(多拷贝)和严紧型(低拷贝)一般来说，接合型质粒相对分子量较大，拷贝数少；非接合型质粒分子量较小，拷贝数多质粒的复制起始决定质粒的拷贝数质粒具有两种调控起始的主要机制1)通过反义RNA调控现在大部分质粒载体(ori来自ColE1质粒)的拷贝数调控方式2)通过关键蛋白调控

Lac筛选(蓝白斑筛选)蓝白斑筛选：pUC质粒含LacZ基因，该酶能分解生色底物X-gal产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入LacZ基因后失活，菌株呈白色，称之为蓝白斑筛选。pUC8等大肠杆菌质粒的缺点不能操作大于10kb的DNA片段大片段的插入会引起重组或干扰质粒的复制体系，且重组DNA分子在宿主细胞中丢失第二节

λ噬菌体基因组载体λ噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期为了能够复制，噬菌体必须进入细菌细胞并促使细菌的酶表达噬菌体基因所包含的信息，以便于细菌能合成新的噬菌体。一旦复制完成，新的噬菌体便离开细菌，并通常引起细菌死亡，并继续感染新的细胞，这称为裂解性感染周期。λ噬菌体基因组整合到细菌染色体上，保持多代的休眠状态，并随细胞分裂而与宿主染色体一起复制，称为溶源性感染周期。λ噬菌体裂解性感染周期与溶源性感染周期λ噬菌体随意DNA(optionalDNA)λ噬菌体基因组大小为48.5kb，其中有15kb只在噬菌体DNA整合到大肠杆菌染色体过程(即溶源性感染周期)中必须，该片段的删除不影响噬菌体感染细菌的能力，也不影响裂解周期中新的λ噬菌体颗粒合成，称为随意DNA。λ噬菌体载体插入型载体(insertionvector)，部分或全部随意DNA被删除，并在删除后的基因组内部某位点引入单一的限制性酶切位点。替代型载体(replacementvector)，随意DNA两侧引入限制性酶切位点，用需克隆的DNA在连入时替代随意DNA。cos位点与体外包装cos位点，λ噬菌体是一个线性分子，其两端具有12个核苷酸、序列互补的单链突出。cos位点处可发生连接形成串联体，当所插入片段大小合适时（连接产物大小在37-52kb间)，就会通过体外包装混合物而包装到衣壳内部。否则，就会被体外包装混合物切下，不被包装。第三节其它载体其它载体用于连入更长DNA片段用于特殊用途：1)得到单链DNA2)RNA表达载体3)蛋白表达载体用于连入更长DNA片段的载体基因组绘图与测序需要把更长(>18kb)的片段连入载体柯斯质粒(cosmid)Fosmids噬菌体P1载体系统(bacteriophageP1vector)BAC(bacterialartificialchromosome)PAC(P1-derivedartificialchromosome)YAC(Yeastartificialchromosome)Mega-YAC用于连入更长DNA片段的载体Cosmid与FosmidsCosmid

1)具有λcos位点的质粒，质粒大小5-8kb2)具有和λ噬菌体一样的感染性3)进入细胞后不能指导合成新的噬菌体颗粒，而是如质粒一样复制，因此重组DNA可以从克隆而不是噬菌斑中得到Fosmids包含了F质粒的复制起始位点和λ载体cos位点。与Cosmid相似，但拷贝数较低酵母人工染色体(YAC)在酵母中繁殖，是以染色体为根据。真核染色体的三个重要组件1)着丝粒2)端粒3)一个或多个复制起始点YAC载体工作原理YAC的优点与缺点优点：天然酵母染色体大小为230-1700kb,因此能插入上至Mb的片段缺点：插入不稳定，克隆的DNA会存在重排现象，形成新的序列组合。BACBAC是基于大肠杆菌F质粒构建的。细菌F质粒是一种较大的质粒，具有插入较大片段的能力，可以克隆300kb及更长的片段，且插入片段很稳定。噬菌体P1载体系统与PAC噬菌体P1载体系统与λ载体类似，但是基因组更大，具有插入更大片段的能力，可以克隆125kb的片段。PAC综合了P1载体系统和BAC的特点，具有克隆长达300kb片段的容量。用于特殊用途的载体用于特殊用途：1)得到单链DNA2)得到RNA探针和双链RNA3)蛋白质表达载体a)最大量合成蛋白b)简化蛋白纯化c)促进蛋白溶解d)促进蛋白外运用于得到单链DNA的载体DNA测序、S1核酸酶作图、寡核苷酸诱变等分子生物学操作需要得到单链DNAM13载体表达载体用于表达RNA和大量蛋白的载体载体启动子经过优化，有利于大肠杆菌RNA聚合酶的结合分为RNA表达载体和蛋白表达载体用于得到RNA探针的表达载体用噬菌体启动子1)活性强2)大肠杆菌启动子不识别3)噬菌体所编码RNA聚合酶，如SP6,T7和T3,是单独多肽链，比大肠杆菌的酶更易于操作用于得到双链RNA的载体具有方向不同的双启动子载体LITMUS载体：具有相反方向的T7启动子，通过限制酶线性化的差异实现不同链的转录LITMUS载体工作原理影响克隆基因蛋白表达的因素启动子的强度转录终止质粒拷贝数质粒稳定性宿主细胞生理状况翻译起始序列密码子选择mRNA结构用于最大量合成蛋白的载体含有可控制的启动子：

1)λPL

2)T73)trc(tac)4)BAD通过诱导实现最大量的表达trc与tac：lac与trp启动子的杂合，可受乳糖与IPTG调控pET载体：T7启动子λPL启动子调控：cl和trp调控pBAD载体：BAD启动子简化蛋白纯化的载体：标签蛋白的引入谷胱甘肽-S-转移酶(GST)

谷胱甘肽琼脂糖麦芽糖结合蛋白(MalE)