碱性磷酸酶米氏常数的测定课件

实验八碱性磷酸酶米氏常数的测定

石巍一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定的原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基酚磷酸为底物时的Km和Vm值。二、原理一、分光光度法的基本原理及方法（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析1．原理（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0A=lg1/T=lgI0/I

A=KCL其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度；K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度2．常用方法 （1）标准曲线法

OD或Ａ

浓度标准曲线与样品的测定条件必须一致。（2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/

（

为L=1cm，C为1mol/L时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。1/v1/Vm

-1/Km1/[S]本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-

无色黄色

可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。

二、分光光度计的使用仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式——透射比（T）、吸光度（A）、已知样品浓度值（C）、已知标准样品斜率（F）“100%”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长3.样品测试操作①打开电源开关，使仪器预热20分钟②用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上③按“方式键”（MODE）将测试方式设置为透射比（T）④将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中⑤打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿和黑体分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖⑥盖好样品室盖，将黑体推或拉入光路，按“0%”键调透射比零⑦将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%”调100.0⑧按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度（A）⑨将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。三、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作取5支试管编号,0号一支,1－7号各二支,按下表操作：管号0123456pNP含量(

mol)00.050.100.150.200.250.300.5

mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.6H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.2Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.1mol/LNaOH(mL)各管加入2.0mLOD405nm

以对硝基苯酚的绝对量(

mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数(

)值。(二）测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。No.12345底物终浓度[S](mM)0.50.751.01.5310mmol/LpNPP（mL）0.10.150.20.30.6蒸馏水（mL）0.50.450.40.300.1N碳酸盐缓冲液（mL）各加1.0mL20mmol/LMgCl2（mL）各加0.2mL预热混匀，37℃，5分钟酶液（mL）测定管各加0.2mL酶液反应时间37℃，精确反应10分钟0.1NNaOH（mL）各加2mL酶液（mL）空白管各补加0.2mL酶液OD405（三）数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量(

mol数),计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以

mol

L-1

min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/[S]作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。四注意事项取液量一定要准确。反应时间一定要精确。加酶前后一定要将试剂混匀。空白对照一定要先加NaOH，后加酶。测定OD405时要以各自的空白调零点。移液管或取液器的使用比色杯的使用返回管号11'22'33'44'55'

加酶时间（min）0.5m1m1.5m2m2.5m3m3.5m4m4.5m5m加NaOH时