HPLC指纹图谱建立的技术要求

第四节HPLC指纹图谱建立的关键技术要求一、药材样品来源〔中间体和注射剂另有规定〕应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法等。供试品的取样参照?中华人民共和国药典?2021年版中规定的中药材取样方法，以保证供试品的代表性和均一性。按1：10取样。二、供试品制备必须确保中药材的主要化学成分在指纹图谱中的表达。多种有效组分应分别提取制备。三、参照物的制备选择适宜的对照品作为参照物，如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。编辑课件四、测定方法包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等必须固定。建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的中药材可以考虑采用多种测定方法，建立多张指纹图谱。注意方法学考察。1、指纹图谱第一，指纹图谱记录时间一般为1小时，但应提供2小时的记录图。第二，TLC法必须提供从原点至溶剂前沿的图谱。第三，对于化学成分复杂，必要时可建立多张指纹图谱。2、共有指纹峰的标定采用色谱方法制定指纹图谱，必须根据参照物的保存时间，计算指纹的相对保存时间。根据10批次的检测结果，标定中药材的共有指纹峰。编辑课件3、共有指纹峰面积的比值〔1〕以参照物峰面积作为1〔要求能出现稳定的峰〕，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值〔参照物可以是对照品也可以是内标物〕。〔2〕以内标物作为参照物的指纹图谱，那么以共有指纹峰中其中一个峰〔要求面积相对较大、较为稳定的共有峰〕的峰面积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值。〔3〕各共有峰的面积比值必须相对固定。〔4〕共有峰面积要求：单峰面积占共有峰总面积20%的共有峰，其差值不得20%；假设20%面积10%共有峰，其差值不得25%；假设面积10%的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保存时间。未到达基线别离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保存时间。编辑课件4、非共有峰面积非共有峰总面积不得总面积的10%。5、方法学考察〔1〕稳定性主要考察供试品的稳定性。取同一供试品，分别在不同时间检测，考察色谱峰的相对保存时间、峰面积的一致性，确定检测时间。〔2〕精密度主要考察仪器的精密度。取同一供试品，连续进样5次以上，考察色谱峰的相对保存时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差RSD不得大于3%。〔3〕重现性主要考察实验方法的重现性。取同一批号的供试品5份以上，按照供试品的制备和检测方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相对保存时间、峰面积比值的一致性。其峰面积比值的相对标准偏差RSD不得大于3%。编辑课件6、其他注意问题〔1〕样品定容一般制成样品的标示浓度单位为g/ml或mg/ml。〔2〕放置供试品溶液应在避光、低温、密闭容器条件下保存，一般不超过两周，溶液不稳定的，一般不超过48小时。〔3〕有效数字相对保存时间和相对峰面积的有效数字要求取小数点后3位。〔4〕留样注意留样的数量不少于实验实际用量的3倍。编辑课件〔5〕参照物复方制剂首选君药的活性成分或指标性成分，尽可能说明参照物的化学结构及化学名称，也可以选择适当的内标物插入色谱中。〔6〕量化的含义是指在定量的操作条件下，所得到的药材指纹图谱在整体特征上可以半定量的比较，以表达原料药材指纹图谱在“量〞方面的总体差异程度，以及半成品〔提取物〕和成品之间及成品批间指纹图谱在“量〞的相对程度。〔7〕相似度软件2004年SFDA?中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件?，一般成品指纹图谱相似度计算结果在0.9-1.0之间为符合要求。编辑课件图2福建太子参HPLC指纹图谱图1福建莲子HPLC指纹图谱编辑课件第五节研究实例丹参HPLC指纹图谱构建一、药材来源〔GAP基地〕与鉴定二、色谱条件与系统适应性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%乙酸〔5：95〕为流动相；检测波长254nm；柱温为室温；流速为1ml/min。编辑课件四、供试溶液的制备40目，10批次，各1g〔精密称取〕，蒸馏水提取，趁热过滤，得提取液100ml，加10%盐酸调pH为2，再用乙酸乙酯40ml萃取1次。萃取液浓缩至干，残渣用1ml流动相溶解，作为供试品溶液，HPLC分析前用微孔滤膜过滤。五、测定分别取各批次药材供试品10l，注入HPLC仪，记录1h色谱。供试品指纹图谱应与质量标准所附的对照指纹图谱有良好的相似性。指纹图谱应有12个特征峰。编辑课件相对保存时间/min〔特征峰序号〕0.150〔1〕、0.368〔2〕、0.437〔3〕、0.495〔4〕、0.591〔5〕、1.000〔S〕、1.143〔6〕、1.393〔7〕、1.627〔8〕、2.585〔9〕、2.911〔10〕3.968〔11〕。特征指纹峰面积积分相比照值0.152±30%(1)、0.72(2)、0.191±30%(3)、0.297±25%(4)、0.046(5)、1.000(S)、0.059(6)、0.038(7)